人sCR1結(jié)合功能域片段基因的克隆與表達(dá).pdf

1、國內(nèi)外的研究證實,過度活化的補(bǔ)體片段介導(dǎo)的嚴(yán)重創(chuàng)(燒)傷后并發(fā)機(jī)會病原菌感染、缺血再灌注損傷等疾病,除了C5a之外還有C3a和C5b-9等成分的共同作用.所以,只針對某一種補(bǔ)體活化片段的防治研究顯然是局限的.在經(jīng)典、旁路和MBL三個補(bǔ)體激活途徑中,都以C3活化為中心,小分子sCR1(SCR15-18)既可滅活C3/C5轉(zhuǎn)化酶,又能結(jié)合C3b,并且還能輔助I因子裂解C3b,阻斷C5a和C5b-9等片段的生成.該文為了構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET

2、32-sCR1-SCR15-18,獲得具有生物學(xué)活性的sCR1結(jié)合功能域片段,采取從人外周血單核細(xì)胞中提取總RNA,以RT-PCR法克隆sCR1結(jié)合C3b功能域(SCR15-18)基因片段;再將目的基因插入pMD18-T載體中進(jìn)行核苷酸序列鑒定;構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET32a,轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21,經(jīng)抗性篩選與陽性重組子酶切鑒定后;再用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),用鎳柱純化目的蛋白;并觀察表達(dá)產(chǎn)物抑制補(bǔ)體溶血反應(yīng)活性.研究取得了以下主要結(jié)果:

3、1.從人外周血單核細(xì)胞中提取總RNA,并以此為模板設(shè)計引物,經(jīng)RT-PCR成功地克隆了編碼人補(bǔ)體受體I型胞外區(qū)sCR1-SCR15-18的cDNA(其長度為753bp),連接于T-載體后測序,經(jīng)查對與GenBank上登錄的編碼相應(yīng)補(bǔ)體受體I型胞外區(qū)cDNA的序列完全一致.2.將測序正確的目的片段插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32,成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32-sCR1-SCR15-18.氨芐青霉素篩選出陽性重組子的質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定確認(rèn).

4、3.將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),均獲得了較高水平的表達(dá),并確立sCR1在大腸桿菌中高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為終濃度1mmol/L的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時.4.經(jīng)Ni<'2+>-NTA純化系統(tǒng)及尿素分步透析,表達(dá)蛋白得到了有效純化和復(fù)性,純化蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶.5.生物學(xué)活性分析顯示,所純化的目的蛋白能抑制補(bǔ)體的溶血反應(yīng).綜上所述:該實驗成功的構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET32-sCR1-SCR1