抑制Notch1、4受體基因的表達(dá)對涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞增殖、侵襲以及遷移的影響.pdf

1、涎腺腺樣囊性癌(saliv aryadenoid cystic carcinoma,SACC),是頭頸部常見的惡性腫瘤之一,具有嗜神經(jīng)侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移兩大生物學(xué)特點,術(shù)后易復(fù)發(fā)。眾多的研究表明,Notch信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn),Notch信號通路中的受體基因Notch1、4在涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SACC-M中表達(dá)明顯高于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SACC-2。本研究以Notch1、4為研究對象,研究其與涎腺腺樣囊性癌細(xì)

2、胞增殖、侵襲及遷移的關(guān)系。研究分為兩個部分,分述如下:
　　一、用siRNA技術(shù)研究Notch1、4基因?qū)ο严傧贅幽倚园┘?xì)胞功能的影響
　　目的:驗證Notch1、4受體基因與涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞增殖、侵襲以及遷移的關(guān)系。
　　方法:根據(jù)Notch1、4的序列設(shè)計合成siRNA,轉(zhuǎn)染SACC-M細(xì)胞,應(yīng)用Real-timePCR技術(shù),研究其Notch1、4的表達(dá)變化;用CCK8法研究Notch1、4表達(dá)被抑制后SACC-

3、M細(xì)胞增殖能力的變化;采用侵襲小室法研究Notch1、4表達(dá)被抑制后SACC-M細(xì)胞侵襲遷移能力的改變。
　　結(jié)果:Real-timePCR檢測結(jié)果顯示Notch1、4的表達(dá)下降;CCK8法研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染72h后,轉(zhuǎn)染siRNA的SACC-M細(xì)胞增殖能力弱于陰性對照組;侵襲小室法研究結(jié)果表明,Notch1、4表達(dá)下降后,SACC-M細(xì)胞的侵襲、遷移能力也隨之下降。
　　結(jié)論:Notch1、4對SACC-M的增殖、侵襲以及遷移能

4、力有影響。
　　二、Notch1、4基因shRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建重組腺病毒載體。
　　方法:根據(jù)文獻(xiàn)選取的Notch1、4的siRNA序列,設(shè)計合成帶有HindⅢ、XhoⅠ酶切位點的shRNA片段;穿梭載體pRNAT-H1.1/Adeno行HindⅢ、XhoⅠ雙酶切后與shRNA片段連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,鑒定正確的質(zhì)粒命名為pRNAT-H1.1-Notch1-1、pRNAT-H1.1-N

5、otch1-2、pRNAT-H1.1-Notch4-1和pRNAT-H1.1-Notch4-2;用PmeI酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化Bj5183進(jìn)行同源重組,PacI酶切鑒定獲重組腺病毒載體pAd-Notch1-1、pAd-Notch1-2、pAd-Notch4-1、pAd-Notch4-2;將pAd-Notch1-1、pAd-Notch1-2、pAd-Notch4-1、pAd-Notch4-2PacI酶切線性化后按脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染AD-

6、293進(jìn)行包裝;通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞GFP的表達(dá),待貼壁細(xì)胞變圓脫落后,收集培養(yǎng)液上清及細(xì)胞,獲取第一代病毒液,并擴(kuò)增至第五代。病毒感染SACC-M后,用Real-timePCR驗證干擾效果。
　　結(jié)果:Real-timePCR檢測針對Notch1基因的shRNA重組腺病毒載體干擾效果達(dá)到50％以上;針對Notch4基因的shRNA重組腺病毒載體干擾效果不佳。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了針對Notch1基因shRNA重組腺病毒載