新型炎癥相關(guān)基因CNT2b的發(fā)現(xiàn)、克隆及功能初探.pdf

1、炎癥和免疫反應(yīng)是一種常見的病理過(guò)程，大多數(shù)的人類疾病均與此有關(guān)。除了人們所熟知的感染性疾病外，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、阿爾茨海默病以及惡性腫瘤等多種疾病也與炎癥密切相關(guān)。炎癥免疫因素參與了這些疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸整個(gè)過(guò)程。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的一種重要細(xì)胞，不僅具有很強(qiáng)的吞噬功能，而且是主要的抗原提呈細(xì)胞，在多種炎癥和免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。活化的巨噬細(xì)胞可分泌多種生物活性物質(zhì)，如一

2、氧化氮、白介素.1、腫瘤壞死因子α、活性氧以及前列腺素、白三烯等花生四烯酸代謝產(chǎn)物。誘生型環(huán)氧酶(cyclooxygenase，COX)-COX-2可大量表達(dá)于巨噬細(xì)胞中。種種研究跡象表明，COX-2并非專一性地參加炎癥反應(yīng)，還在保護(hù)胃粘膜、維護(hù)腎臟功能、學(xué)習(xí)記憶等方面發(fā)揮重要作用，可能還存在其它亞型。眾多的炎癥因子在炎癥反應(yīng)的不同時(shí)期組成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，相互作用，共同調(diào)控炎癥反應(yīng)的的進(jìn)程和預(yù)后。巨噬細(xì)胞在炎癥免疫反應(yīng)中所起的重要作用，且其

3、在誘導(dǎo)狀態(tài)下能大量表達(dá)COXs，因此我們擬針對(duì)COX的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，選擇急性炎癥誘導(dǎo)下的巨噬細(xì)胞cDNA作為模板克隆新型COX亞型或炎癥相關(guān)性基因，并對(duì)其表達(dá)特征和功能進(jìn)行初步研究。 方法: 1.分析不同物種、不同亞型的COX的保守序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。 2.采用腹腔注射酵母多糖A的方法建立SD大鼠急性腹膜炎模型，采集腹腔巨噬細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接T載體，轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)菌，

4、抽提質(zhì)粒，測(cè)序。 3.選取新型序列，進(jìn)行3’，5’快速末端反應(yīng)，獲取全長(zhǎng)基因序列。 4.采用Realtime RT-PCR法分別檢測(cè)新基因CNT2 mRNA、CNT2b mRNA在大鼠不同臟器組織中的表達(dá)情況，以及在酵母多糖誘導(dǎo)的急性腹膜炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)相特征。 5.應(yīng)用Realtime RT-PCR法觀察抗炎藥物阿司匹林(12mg/kg)、塞來(lái)昔布(0.13mg/kg)和潑尼松(0.4mg/kg)對(duì)

5、大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中CNT2b mRNA和CNT2 mRNA表達(dá)的影響。 6.針對(duì)CNT2b序列設(shè)計(jì)siRNA干擾序列，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞；Realtime RT-PCR法檢測(cè)干擾后細(xì)胞中炎癥相關(guān)因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、IL-10以及CNT2、CNT2b等分子的mRNA表達(dá)情況。 結(jié)果: 1.不同物種的COX-1、COX-2和COX-3序列中存在兩段

6、氨基酸保守序列。 2.從大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并克隆了一個(gè)新基因，全長(zhǎng)13330nt，為—mRNA序列，對(duì)應(yīng)DNA位于大鼠第三號(hào)染色體3q35區(qū)。經(jīng)BLAST分析與序列比對(duì)，該基因與Na+依賴性核苷轉(zhuǎn)運(yùn)載體(Na+/nucleoside cotransporter，CNT)2有較高同源性，保留了CNT2的第1、7～14、16、17內(nèi)含子；并且，在CNT2的最后一個(gè)(第18個(gè))外顯子后，又附加了一段3169nt長(zhǎng)的序列。由于該基因

7、和CNT2均包含加尾信號(hào)和polyA尾巴，均為完整的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，故確定為CNT2的剪接異構(gòu)體，已提交Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)并獲得登錄號(hào)：EU032627.2，重新命名為CNT2b。 3.CNT2 mRNA在全身各器官均有表達(dá)，其中在心臟、肝臟、平滑肌、脾臟表達(dá)較高；CNT2b mRNA在正常器官中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于CNT2 mRNA，其中心臟、平滑肌、肝臟表達(dá)稍高。 4.CNT2b mRNA在腹膜炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的表達(dá)具有顯

8、著時(shí)相特征。注射酵母多糖后，其表達(dá)顯著升高，至2h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)；隨后，表達(dá)量逐漸降低，至24h時(shí)基本恢復(fù)至0.5h時(shí)的水平；致炎后36h，表達(dá)量再次明顯升高，至第48h時(shí)又降至36h時(shí)的47.52％。CNT2 mRNA在腹膜炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的表達(dá)也具有類似特征，其時(shí)相變化幅度遠(yuǎn)少于CNT2b mRNA。 5.三種抗炎藥物阿司匹林、潑尼松、塞來(lái)昔布均能明顯降低CNT2b mRNA表達(dá)量。在臨床使用劑量下，潑尼松作用最強(qiáng)，阿司匹

9、林次之，塞來(lái)昔布最弱。 6.抑制CNT2b基因表達(dá)后NR8383細(xì)胞中IL-1βmRNA，IL-6 mRNA，TNF-αmRNA，COX-2 mRNA的表達(dá)均顯著升高，IL-10 mRNA的表達(dá)明顯降低。 結(jié)論: 1.在大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并克隆了一個(gè)新基因CNT2b。 2.CNT2b屬于炎癥誘導(dǎo)性高表達(dá)基因，在正常組織中很少表達(dá)，而在急性炎癥刺激的巨噬細(xì)胞中表達(dá)顯著增加。在大鼠急性腹膜炎過(guò)程中，腹腔巨