致死性EV71感染的病理學(xué)及分子病毒學(xué)研究.pdf

1、手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由腸道病毒感染引起的一種嚴(yán)重的傳染病,并呈現(xiàn)逐年高發(fā)態(tài)勢(shì)。近年發(fā)現(xiàn)HFMD主要病原體為腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71),兒童為EV71易感人群。兒童感染EV71后臨床表現(xiàn)形式多樣,除典型的HFMD外,還常表現(xiàn)出嚴(yán)重的中樞神經(jīng)疾病及肺水腫和/或肺淤血等并發(fā)癥,嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡。目前對(duì)于EV71感染引發(fā)HFMD的發(fā)生發(fā)展過程尚不清楚,且缺乏

2、有效的預(yù)防及治療方法,常導(dǎo)致臨床醫(yī)療嚴(yán)重后果的發(fā)生,因此明確HFMD病原,全面分析EV71感染后病理改變,探討發(fā)病機(jī)理,以及研發(fā)安全、有效的HFMD疫苗成為預(yù)防和控制HFMD疾病暴發(fā)的有效手段之一。據(jù)此,本論文從一例疑似HFMD的死亡案例出發(fā),從法醫(yī)病理學(xué)、分子病毒學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等幾個(gè)方面對(duì)該病例及其致病病原EV71進(jìn)行了深入的研究,具體內(nèi)容有以下五個(gè)章節(jié)。
　　第一章以文獻(xiàn)綜述的形式介紹了HFMD及EV71的研究背景,主要包括HF

3、MD的流行情況,其主要病原體EV71的病毒學(xué)特點(diǎn),流行病學(xué)研究,致病機(jī)理研究,EV71感染的臨床診斷和治療,疫苗的研究現(xiàn)狀,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇以及桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的原理、技術(shù)路線及其作為基因工程疫苗載體的研究進(jìn)展等。最后說明了本論文研究的內(nèi)容及意義。
　　第二章利用常規(guī)法醫(yī)病理學(xué)分析方法,對(duì)一例疑似HFMD致死案例進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)CNS病變明顯,神經(jīng)細(xì)胞壞死、膠質(zhì)小結(jié)形成、炎細(xì)胞呈袖套樣浸潤,肺水腫顯著、炎癥突出,確認(rèn)死因?yàn)椴《拘阅X炎

4、及病毒性肺炎導(dǎo)致的急性呼吸、循環(huán)功能衰竭。在此基礎(chǔ)上利用RT-PCR技術(shù),以國家CDC指導(dǎo)的EV71通用檢測(cè)引物,證實(shí)病原體為EV71。隨后針對(duì)EV71保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增,檢測(cè)了各病理組織的病毒載量;利用抗EV71 VP1蛋白的特異性多克隆抗體對(duì)石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了病毒抗原的組織分布。結(jié)果顯示此病例腦組織EV71病毒載量相對(duì)較高,其中腦干和頸髓最高;病毒抗原檢測(cè)陽性主要集中在CNS的神經(jīng)細(xì)胞及炎細(xì)胞,為

5、病毒感染復(fù)制的主要部位;肺組織雖病變明顯,水腫/淤血突出,但病毒核酸及抗原陰性,并非病毒主要感染復(fù)制部位;
　　第三章自病毒載量最高的腦干組織出發(fā),在體外 RD細(xì)胞上進(jìn)行病毒的分離、傳代及空斑純化,通過一步法生長曲線的方法了解不同株純化病毒的感染性差異,同時(shí)利用EV71-VP1基因的序列對(duì)病毒株進(jìn)行基因分型。篩選出一株純化病毒,擴(kuò)增出核酸序列進(jìn)行分段克隆,獲得EV71病毒的全基因組,并提交GenBank。結(jié)果顯示:腦干組織能成功分

6、離到EV71-xf活病毒,在 RD細(xì)胞上能產(chǎn)生腸道病毒特異性致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),透射電鏡能觀察到大小均勻、形態(tài)一致、直徑約20-30nm的EV71病毒粒子。經(jīng)空斑純化后的四株病毒在體外RD細(xì)胞上感染性基本無差別,VP1測(cè)序結(jié)果顯示均為C4亞型;完成了一株病毒的全基因組測(cè)序,基因組全長為7405bp,GenBank登錄號(hào)(Accession number)為JQ804832,基因組序列提示此次感染

7、病毒仍為國內(nèi)流行株C4亞型,全基因組序列的測(cè)定將有利于后續(xù)的深入研究。
　　第四章對(duì)純化的EV71-xf病毒進(jìn)行了建立小動(dòng)物感染模型的初步摸索。通過顱腔注射(Intracranial injection,IC)的途徑使1日齡Balb/c小鼠感染EV71-xf病毒,觀察其表現(xiàn),隔周采血對(duì)血清特異性抗體IgG及中和抗體進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)分離鼠腦組織中病毒再次接種1日齡小鼠,獲得鼠適性毒株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1日齡Balb/c小鼠能通過IC途徑感染E

8、V71-xf,但無明顯的神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn);血清抗體IgG在感染兩周后較高,但仍處于亞中和抗體水平;IC二次感染可以刺激小鼠產(chǎn)生更高濃度IgG,并在RD細(xì)胞上表現(xiàn)出較好的特異性及交叉性中和保護(hù)作用;母?jìng)骺贵w的中和保護(hù)作用較強(qiáng),但時(shí)間短暫,約4w齡時(shí)其保護(hù)作用消失;反復(fù)多次鼠腦適應(yīng),可以得到感染性增強(qiáng)的鼠適株EV71-xf/A/J/Q,但其毒力情況還需進(jìn)一步研究。
　　第五章利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)開展了EV71基因工程疫苗的初步研究。將

9、編碼EV71-xf的P1和3CD蛋白的基因分別克隆至pFastBac-Dual載體的啟動(dòng)子pPh和pP10下游的多克隆位點(diǎn),構(gòu)建重組pFastBac Dual-EV71-xf-3CD-P1質(zhì)粒。重組質(zhì)粒與桿狀病毒Bacmid轉(zhuǎn)座后獲得重組Bacmid Bac-EV71-xf-3CD-P1。提取重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞,獲得重組病毒,重組病毒感染昆蟲細(xì)胞后,表達(dá)的前體蛋白P1在蛋白水解酶3CD的剪切后自組裝為病毒樣顆粒(

10、Virus Like Particle,VLPs),經(jīng)蔗糖及氯化銫密度梯度離心進(jìn)行初步的純化,Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)與剪切,透射電鏡觀察VLPs顆粒;另外還構(gòu)建了新的穩(wěn)定表達(dá)3CD的細(xì)胞系Sf9-3CD,用于VLPs的構(gòu)建策略。結(jié)果顯示,重組桿狀病毒AcBac-EV71-xf-3CD-P1在Sf9細(xì)胞內(nèi)能同時(shí)表達(dá)前體蛋白P1和蛋白水解酶3CD,3CD能正確剪切P1蛋白成為VP1等結(jié)構(gòu)蛋白,并自組裝為VLPs,經(jīng)蔗糖及氯

11、化銫密度梯度離心等初步純化后,Western Blot顯示VLPs具有VP1的抗原表位,透射電鏡觀察VLPs的形態(tài)、大小及構(gòu)象均類似于天然的EV71病毒粒子,可以作為EV71疫苗的候選物。Sf9-3CD細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)3CD蛋白并剪切P1,形成VLPs,可以作為構(gòu)建VLPs的新途徑。
　　綜合以上研究內(nèi)容,本研究完成了一例疑似HFMD案例的法醫(yī)病理學(xué)分析,確定了其致病病原為腸道病毒EV71,并從病理組織中分離、純化到一株高活性的E