重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)糖尿病大鼠腦缺血后神經(jīng)再生和神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、目的： 糖尿病合并腦梗死是引起人類死亡和殘疾的主要原因，目前尚缺少促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的有效方法。干細(xì)胞療法是最有希望解決神經(jīng)再生的方法。骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療腦缺血在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中已經(jīng)取得了明顯的效果，但它仍然是一種復(fù)雜的操作，增加了感染的機(jī)會(huì)，并且有可能錯(cuò)過治療的時(shí)間窗。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)是一種對(duì)調(diào)控骨髓干細(xì)胞增生、分化和存活有顯著作用的細(xì)胞因子，可動(dòng)員造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)，在治療實(shí)驗(yàn)性心肌缺

2、血和腦缺血方面效果顯著。本實(shí)驗(yàn)試圖從rhG-CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞，激活腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的角度探討rhG-CSF對(duì)糖尿病合并腦梗死的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制，觀察經(jīng)過rhG-CSF干預(yù)之后，局灶性腦缺血糖尿病大鼠的神經(jīng)功能和腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化，缺血周邊區(qū)G-CSFR、STAT3、pSTAT3、VEGF、IGF-1、BrdU表達(dá)的變化，TUNEL陽性的凋亡神經(jīng)細(xì)胞及Bcl-2、VEGF的蛋白和基因變化，以及細(xì)胞共表達(dá)BrdU+NeuN+、Brd

3、U+GFAP+的情況，驗(yàn)證rhG-CSF能否改善糖尿病大鼠合并腦梗死的神經(jīng)功能，其作用是否通過增加VEGF、IGF-1的表達(dá)，拮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)神經(jīng)再生而實(shí)現(xiàn)，以及其配體-受體的相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能途徑。 方法： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備及分組wister大鼠采用2次給藥法制備大鼠糖尿病模型，6周后采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型。隨機(jī)分成rhG-CSF干預(yù)組、對(duì)照組，每組又隨機(jī)分為缺血7d、14d和

4、21d時(shí)間點(diǎn)組，每一時(shí)間點(diǎn)均為12只大鼠。 2、rhG-CSF干預(yù)及BrdU標(biāo)記rhG-CSF干預(yù)組大鼠術(shù)后每日皮下注射rhG-CSF50μg/kg，各時(shí)間點(diǎn)組按組分別注射7、14和21天。對(duì)照組注射等量的生理鹽水。各組均從術(shù)后第1天開始，腹腔注射BrdU10mg/kg.d，分別連續(xù)注射7、14和21天以標(biāo)記處于分裂期的細(xì)胞。 3、神經(jīng)功能評(píng)分每只動(dòng)物均于術(shù)后第1天和處死前采用神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(NSS)進(jìn)行神經(jīng)功能缺

5、損評(píng)分，觀察rhG-CSF對(duì)糖尿病腦缺血大鼠神經(jīng)功能的影響。 4、透射電鏡觀察rhG-CSF對(duì)腦組織超微結(jié)構(gòu)的改變。 5、Tunel染色方法檢測(cè)rhG-CSF對(duì)腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。 6、免疫組化方法檢測(cè)rhG-CSF對(duì)腦組織中BrdU、G-CSFR、VEGF、IGF-1的表達(dá)的影響。 7、免疫熒光檢測(cè)rhG-CSF對(duì)腦組織中細(xì)胞共表達(dá)BrdU+NeuN+、BrdU+GFAP+情況的影響。

6、8、WesternBlot方法檢測(cè)rhG-CSF對(duì)腦組織中STAT3、pSTAT3、VEGF、BCL-2蛋白表達(dá)的影響。 9、RT-PCR方法檢測(cè)rhG-CSF對(duì)腦組織中神經(jīng)細(xì)胞VEGF、BCL-2基因的mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1、rhG-CSF干預(yù)組和對(duì)照組術(shù)后第1天的神經(jīng)功能缺損評(píng)分無明顯差異；rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天的神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。 2、透射電子

7、顯微鏡下觀察到對(duì)照組腦組織缺血后細(xì)胞核膜破裂，染色質(zhì)邊聚，細(xì)胞膜破裂，各種細(xì)胞器破壞。rhG-CSF組也可觀察到上述破壞的神經(jīng)元，但超微結(jié)構(gòu)的損傷明顯減輕。 3、TUNEL染色結(jié)果顯示：rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦缺血周邊區(qū)TUNEL免疫陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(P＜0.01)。 4、免疫組化染色結(jié)果顯示：rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦缺血周邊區(qū)VEGF免疫陽性細(xì)胞光密度值明顯多于對(duì)照組(P＜0.0

8、1)；rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦缺血周邊區(qū)IGF-1免疫陽性細(xì)胞光密度值明顯多于對(duì)照組(P＜0.01)；rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦缺血周邊區(qū)BrdU免疫陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組(P＜0.01)；rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦缺血周邊區(qū)G-CSFR免疫陽性細(xì)胞光密度值明顯多于對(duì)照組(P＜0.01)。 5、免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示：rhG-CSF干預(yù)組腦缺血周邊區(qū)可觀察到共表達(dá)BrdU+NeuN

9、+細(xì)胞，對(duì)照組未觀察到共表達(dá)BrdU+NeuN+細(xì)胞；rhG-CSF干預(yù)組和對(duì)照組都未觀察到共表達(dá)BrdU+GFAP+細(xì)胞。 6、Westernblot結(jié)果顯示：rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦組織STAT3蛋白表達(dá)與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)。rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦組織pSTAT3蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組

10、(P＜0.01)。rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦組織VEGF蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。 7、RT-PCR結(jié)果顯示：rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦組織Bcl-2mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。rhG-CSF干預(yù)組第7、14、21天腦組織VEGFmRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。 結(jié)論： 1、rhG-CSF能明顯改善糖尿病大鼠局灶性腦缺血后的神經(jīng)功能。

11、2、rhG-CSF可以明顯減輕糖尿病大鼠局灶性腦缺血后的超微結(jié)構(gòu)損害。 3、rhG-CSF可以明顯減少糖尿病大鼠局灶性腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡；并能明顯增加抗凋亡因子Bcl-2的mRNA和蛋白的表達(dá)。 4、rhG-CSF可以增加腦缺血周邊區(qū)的VEGF、IGF-1、BrdU、G-CSFR蛋白的免疫組化表達(dá)。 5、rhG-CSF對(duì)STAT3蛋白的表達(dá)無明顯影響，能明顯增加pSTAT3蛋白的表達(dá)。 6、rhG-C