頸椎后縱韌帶骨化癥發(fā)病機(jī)制的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的: 頸椎后縱韌帶骨化癥(ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是臨床上常見的脊柱疾患,發(fā)病率可高達(dá)20％～34％。OPLL的致癱幾率顯著高于其他頸椎退變性疾病,其原因包括缺乏有效的早期篩選和診斷方法、自然史不明無法確定手術(shù)時機(jī)、術(shù)后骨化物持續(xù)生長等。近年來對其發(fā)病機(jī)制的研究取得了一些成果,如COL6A1限制性片段多態(tài)性與OPLL相關(guān)、應(yīng)力因素是骨化灶進(jìn)展的重

2、要局部因素等,但其發(fā)病機(jī)制仍不明確。本研究采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法,以熒光差異凝膠電泳(differential gel electrophoresis,DIGE)及質(zhì)譜技術(shù)篩選并鑒定OPLL患者頸椎后縱韌帶組織中差異表達(dá)蛋白質(zhì),以期尋找OPLL發(fā)生、發(fā)展過程中特異的蛋白標(biāo)記物,為臨床OPLL篩查和診斷、預(yù)后判斷、尋找治療藥物靶點、了解OPLL發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。 方法: 以頸椎前路椎體次全切除術(shù)中獲得的OPL

3、L后縱韌帶組織和外傷患者正常后縱韌帶組織做為研究對象。液氮研磨、超聲破碎抽提組織全息蛋白質(zhì)樣本,普通雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分離,銀染顯色鑒定蛋白質(zhì)樣本質(zhì)量。以Cy3、Cy5及Cy2熒光素標(biāo)記的OPLL頸椎后縱韌帶組織及健康外傷患者韌帶組織的蛋白質(zhì)標(biāo)本各50 ug進(jìn)行2-DE,以所有樣本等量混合物50 ug做為內(nèi)參,獲得其熒光差異表達(dá)圖譜,DeCyder 6.5圖譜分析軟件

4、(GE healthcare公司)進(jìn)行膠內(nèi)、生物學(xué)差異分析,確定表達(dá)存在差異的蛋白質(zhì)點。加大上樣量同法獲得普通2-DE制備膠,手工切膠后酶解獲得肽段樣本。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrum,MALDI-TOF MS)或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(Liquid chromatography-Mass

5、 spectrum,LC/MS)進(jìn)行鑒定并分析差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點。文獻(xiàn)回顧總結(jié)各差異蛋白的基本信息、分子功能、細(xì)胞分布及其參與的生命過程,推測其在OPLL發(fā)病機(jī)制中的可能作用。對有深入研究價值的差異表達(dá)蛋白質(zhì)采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-TimeQuantitive Polymerase Chain Reaction RT-PCR)技術(shù)從mRNA水平進(jìn)一步驗證DIGE及質(zhì)譜結(jié)果準(zhǔn)確性。 結(jié)果:超聲破碎后行普通2-DE

6、獲得10張2-DE圖譜,圖譜重復(fù)性好,蛋白質(zhì)抽提、分離情況及電泳條件滿意。行熒光差異雙向凝膠電泳獲得4張熒光膠圖及12張模擬膠圖,每張膠圖上共約1100個蛋白質(zhì)點。膠間比較(Biological VariationAnalysis,BVA)共篩選出50個差異表達(dá)蛋白質(zhì)點,其中8個蛋白質(zhì)點在OPLL韌帶組織中上調(diào),42個蛋白質(zhì)點下調(diào)；最大上調(diào)比例為2.74倍；最大下調(diào)比例為7.42倍。手工切膠獲得45個蛋白質(zhì)點的肽段樣本,分別采用MALD

7、I-TOF MS、MALDI-TOF-TOF MS和高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜,鑒定為28個蛋白質(zhì)或肽段。文獻(xiàn)回顧后根據(jù)蛋白質(zhì)功能的不同,將其分為7類：轉(zhuǎn)運和結(jié)合蛋白、代謝酶類、血纖維蛋白、免疫球蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、信號蛋白和未知功能蛋白。其中Vial的編碼基因COL6A1在近年對孿生子和OPLL家系的研究中已確定為OPLL發(fā)病的重要危險因素,本研究首次確認(rèn)其在蛋白水平存在差異表達(dá)；與膠原蛋白代謝相關(guān)的酶PRELP在OPLL韌帶組織中表達(dá)亦有

8、減少,該酶的功能目前尚不完全明確；OGN與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogeneic protein,BMP)存在協(xié)同關(guān)系,后者目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的最重要的誘導(dǎo)成骨因子；N-RAP具有應(yīng)力傳導(dǎo)的作用,而應(yīng)力已被證實是OPLL病情進(jìn)展的重要局部因素,N-RAP有可能在力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為生物信號的過程中發(fā)揮一定作用。RT-PCR驗證實驗發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶(carbonic anhydrase I,CA1)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的激素脫氫酶(NA

9、D(P) dependent steroid dehydrogenase-like,NDSHL),骨生成誘導(dǎo)因子(osteoglycin OG,OGN),VI型膠原α鏈(alpha-1 collagenVI,VIα1)在OPLL韌帶組織中mRNA拷貝數(shù)低于正常韌帶組織,但CA1、OGN的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。膽綠素還原酶B(biliverdin reductase B,BVRB),伴肌動蛋白相關(guān)錨定蛋白(nebulin-related

10、anchoring protein,N-RAP)在OPLL韌帶組織中mRNA拷貝數(shù)高于正常韌帶組織,但BVRB的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另外,本研究發(fā)現(xiàn)一個假設(shè)蛋白和一個未命名蛋白在胃癌組織中表達(dá)上調(diào),它們可能與OPLL的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。 結(jié)論: 本研究探索了后縱韌帶組織全蛋白質(zhì)的抽提方法,成功制備了OPLL韌帶組織和正常后縱韌帶組織的雙向凝膠,初步建立了頸椎后縱韌帶組織的2-DE參考凝膠圖譜。應(yīng)用DIGE技術(shù)探索了OPL

11、L的發(fā)病機(jī)制,建立了定量比較蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)路線。以往OPLL發(fā)病機(jī)制研究停留在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域或針對個別蛋白質(zhì)的局限性,本研究首次把定量比較蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于OPLL發(fā)病機(jī)制的研究,為臨床相關(guān)疾病的同類研究進(jìn)行了技術(shù)探索。DIGE實驗篩選出VIa1表達(dá)存在差異,與既往研究吻合,在一定程度上驗證了DIGE實驗的準(zhǔn)確性。在DIGE篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中可能存在與OPLL發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的重要蛋白,為進(jìn)一步深入研究OPLL發(fā)病機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)

12、。初步的鑒定研究提示,膠原蛋白的表達(dá)和代謝異常在OPLL的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。RT-PCR實驗中,OGN、BVRB實驗結(jié)果與DIGE和質(zhì)譜實驗結(jié)果不符合,考慮有可能是樣本量、實驗誤差或RNA-蛋白之間的不一致性導(dǎo)致。下一步,我們將對質(zhì)譜鑒定的差異蛋白進(jìn)行免疫組化、ELISA等實驗以及RNA干擾,進(jìn)一步驗證其表達(dá)變化,深入研究這些蛋白在OPLL的發(fā)生、發(fā)展過程中可能的作用,為發(fā)現(xiàn)診斷及預(yù)后判斷的蛋白標(biāo)志物,尋找治療藥物靶點,了解OP