半滑舌鰨補體調(diào)控因子I的鑒定、重組表達、功能分析及C3-1基因的初步研究.pdf

1、補體(complement system)系統(tǒng)是動物體免疫系統(tǒng)進化歷程中出現(xiàn)比較早的抵抗外源微生物入侵的重要成分，魚類補體由35種以上蛋白質(zhì)裂解酶、酶抑制因子和受體構(gòu)成，是機體內(nèi)復(fù)雜的限制性蛋白溶解系統(tǒng)，分為經(jīng)典途徑(Classical pathway，CP)，旁路途徑(Alternative pathway,AP)和凝集素途徑(Lectin pathway,LCP)三種激活途徑，能夠識別外來病原入侵信號，參與魚類特異性免疫反應(yīng)和非特異

2、性免疫反應(yīng)，在先天性和獲得性免疫起重要作用。補體調(diào)控因子I(complement factor I,Cfi)是一類在補體系統(tǒng)級聯(lián)反應(yīng)中扮演重要作用的絲氨酸蛋白酶，主要在肝臟中合成，發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)的作用，在一些底物調(diào)控輔因子，例如 Cfh(Complement factor H)、C4bp(C4 Binding Protein)和CR1(Complement Receptor1)的存在下，Cfi能夠切割并抑制C3b和C4b的活性，防止生物

3、體補體系統(tǒng)的過度激活，發(fā)揮調(diào)控補體系統(tǒng)的作用；補體C3分子是一類重要的免疫學(xué)分子，是血清中含量最高的補體成分，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中，都起著重要的作用。在三種補體途徑中，補體C3分子是作為重要的交匯分子存在著，C3主要由巨噬細胞和肝臟合成，在C3轉(zhuǎn)化酶的作用下，裂解成C3a和C3b兩個片段，進而在抗原抗體復(fù)合物或病原體的刺激下，通過級聯(lián)反應(yīng)，活化補體C3，隨后在靶細胞表面上形成膜攻擊復(fù)合體，最終達到裂解靶細胞的目的。
　　

4、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國重要的養(yǎng)殖鲆鰈魚類之一，然而病害問題，特別是細菌性疾病在很大程度上制約了半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本實驗室近五年來開始了半滑舌鰨補體系統(tǒng)的研究，本論文研究內(nèi)容是半滑舌鰨
　　補體調(diào)控因子I進行了基因的鑒定、原核重組蛋白的表達以及其活性蛋白的功能分析，C3-1基因進行了克隆鑒定及感染鰻弧菌后mRNA的表達分析，主要研究結(jié)果如下：
　　1.半滑舌鰨補體Cfi基因的研

5、究
　　1.1 Cfi克隆鑒定及序列分析
　　在本實驗已經(jīng)構(gòu)建的半滑舌鰨cDNA文庫及已有的Cfi研究工作的基礎(chǔ)上，本研究通過普通PCR克隆測序，獲得了半滑舌鰨Cfi全長cDNA(命名為Cscfi)序列為2231bp，包括99bp5’-非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)，164bp3’-UTR，1968bp開放閱讀框(open reading frame,ORF)。預(yù)測的蛋白編碼656個氨基酸(ani

6、mo acid,aa)，多肽鏈的分子量為72.28kDa，等電點pI為7.11。與其它脊椎動物，包括哺乳動物、鳥類、軟骨魚、硬骨魚及兩棲類Cfi蛋白的同源比對結(jié)果顯示，序列相似性高達39％-65%，Cfi蛋白具有一段由30個氨基酸組成的信號肽和5個保守域，即FIMAC(Factor I membrane attack complex)結(jié)構(gòu)域、SRCR(Scavenger receptor cysteine-rich)結(jié)構(gòu)域、LDLa1(

7、Low-density lipoprotein receptor type A1)結(jié)構(gòu)域、LDLa2(Low-density lipoprotein receptor type A2)結(jié)構(gòu)域和SP(Trypsin-like serine protease)結(jié)構(gòu)域。成熟的Cfi是由重鏈和輕鏈組成的異質(zhì)二聚體，F(xiàn)IMAC、SRCR、LDLa1和LDLa2組成重鏈，SP結(jié)構(gòu)域組成輕鏈，重鏈和輕鏈之間由四個帶正電荷的氨基酸(Arg-Val-Ar

8、g-Arg，RVRR)連接，N連接的糖基化位點有7個，其中6個位于重鏈，1個位于輕鏈，且序列中存在大量保守的半胱氨酸。
　　1.2 Cfi重組蛋白的獲得及功能分析
　　根據(jù)獲得的Cscfi基因序列，設(shè)計特異性引物，以肝臟組織cDNA為模板，PCR擴增獲得 Cfi的ORF序列。根據(jù)T-A克隆原則將其連接到表達載體pEASY-E1質(zhì)粒中，構(gòu)建成原核表達載體pEASY-E1-Cfi，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)plyS中，誘導(dǎo)

9、表達重組蛋白(recombinant protein of CsCfi，rCsCfi)。根據(jù)親和層析原理，使用GE-AKaTaBox-900液相色譜分離系統(tǒng)和His TrapTM FF柱子分離純化得到rCsCfi蛋白，并使用SDS-PAGE電泳檢測純化效果。通過Western Blot和二級質(zhì)譜驗證rCsCfi蛋白的可信度，Western Blot結(jié)果顯示雜交顯色后在70kDa處獲得單一條帶，二級質(zhì)譜結(jié)果顯示 rCsCfi蛋白分子量大小

10、71.38kDa，等電點(pI)為6.67，與預(yù)測大小基本相符，并且有15條多肽段與預(yù)測序列能夠匹配，且氨基酸的覆蓋率為62%。通過菌落計數(shù)法分別檢測了其對三種革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(Escherichia coli)、希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，和一種革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑菌效果。結(jié)果表明，r

11、CsCfi蛋白對兩種類型菌都有廣譜抑制效果，其中對大腸桿菌的最低抑菌濃度(英文全稱，MIC)在0.03mg/mL和0.08mg/mL之間，對其它三種菌的MIC范圍是0.01-0.05mg/mL。此外，采用腹腔注射法向健康半滑舌鰨分別注射濃度為0.6μg/g、0.8μg/g、1.0μg/g、1.2μg/g和1.5μg/g的rCsCfi蛋白后，在注射蛋白后0h、6h、12h、24h和48h5個時間點檢測四種主要的免疫組織（肝臟、脾臟、頭腎及

12、小腸）中Cfi下游基因C3-1及Cfh表達量變化，結(jié)果顯示C3-1和Cfh表達量都有顯著的變化，且變化的趨勢在各個濃度下呈現(xiàn)基本一致的趨勢，在1.5μg/g的濃度下各個組織中C3-1和Cfh的變化適中且表達量較高。選取濃度為1.5μg/g的rCsCfi蛋白進行腹腔注射，在注射蛋白后0h、6h、12h、24h、48h、72h、96h和7d8個時間點檢測四種免疫組織（肝臟、脾臟、頭腎及小腸）中Cfi下游基因C3-1及Cfh表達量變化，結(jié)果顯

13、示在脾臟、肝臟和小腸中，重組蛋白引起C3-1及Cfh基因分別在注射后6h、12h和48h出現(xiàn)最大值，為注射前的幾倍到幾十倍，其中，在肝臟中表達量變化最大。在腎臟中，重組蛋白能引起C3-1及Cfh基因下調(diào)表達，在24h達到最低點。
　　2.半滑舌鰨補體C3-1初步研究
　　2.1 C3-1克隆驗證及序列分析
　　本研究通過實驗室構(gòu)建好的半滑舌鰨cDNA文庫，獲得了半滑舌鰨補體C3-1的部分cDNA序列，克隆號為(csgt

14、sa0_0003_A04)。根據(jù)已有序列設(shè)計特異性引物，以肝臟 cDNA為模板，使用RACE(rapid amplification of cDNA ends)和普通PCR克隆測序技術(shù)擴增獲得了長度為5130bp的半滑舌鰨補體基因C3-1的全長cDNA序列（命名為CsC3-1），包括37bp5’-UTR，128bp3’-UTR和4965bp的ORF序列。在線軟件預(yù)測結(jié)果顯示半滑舌鰨 C3-1基因編碼1655個aa，多肽鏈的分子量為184

15、.98kDa，等電點pI值為6.46。半滑舌鰨補體C3-1的氨基酸二級結(jié)構(gòu)從C端到N端依次為：信號肽SP（1-23aa）、α-巨球蛋白結(jié)構(gòu)域A2M-N（130-227aa）、α-巨球蛋白結(jié)構(gòu)域A2M-N-2（453-593aa）、過敏毒素同源結(jié)構(gòu)域ANATO（682-717aa）、α-巨球蛋白結(jié)構(gòu)域A2M（759-858aa）、α-巨球蛋白巰基脂類形成結(jié)構(gòu)域Thiol-ester-C1（992-1022aa）、α-巨球蛋白補體組分結(jié)構(gòu)域

16、A2M-Comp（1044-1274aa）、α-巨球蛋白受體結(jié)構(gòu)域A2M-recep（1383-1477aa）和神經(jīng)生長因子 C端結(jié)構(gòu)域C345C（1516-1636aa）。進化樹結(jié)果表明半滑舌鰨C3-1首先與牙鲆魚聚為一支，進而與其他硬骨魚聚為一類，遠離哺乳動物、兩棲類和鳥類。多序列氨基酸比對結(jié)果表明C3-1相似度在40-69%之間，顯示其結(jié)構(gòu)在進化上的保守性。
　　2.2 鰻弧菌感染前后C3-1的表達特征
　　實時定量P

17、CR結(jié)果顯示：在健康的半滑舌鰨9種組織（肝臟、脾臟、頭腎、血液、皮膚、腦、肌肉、鰓和腸）中均有C3-1的表達，在腦中表達量最高，其次為肝臟、肌肉和血液，在腎和鰓中表達量較低，在腦和肝臟中的表達量明顯高于其他組織；在實驗室已獲得鰻弧菌(Vibro anguillarum)半致死濃度的基礎(chǔ)上，人工腹腔注射2×107CFU(colony forming units)鰻弧菌后解剖獲取4種免疫組織(肝臟、血液、脾臟、頭腎)提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后進行

18、實時定量PCR(real-time quantative PCR)表達分析，鰻弧菌感染半滑舌鰨后，各組織中C3-1的變化都會相應(yīng)的上調(diào)或者下調(diào)表達。在肝臟和血液中，C3-1表達量都在12h達到最高，分別是感染前的5.5和15.5倍，24h肝臟中出現(xiàn)下調(diào)表達，達到最低，為感染前的0.3倍。在頭腎中，C3-1表達量分別在6h和24h有很高的表達量變化，在24h達到最高，為感染前的幾十倍。在脾臟中，C3-1表達量在第7d之前都一直處于下調(diào)表達

19、，7d的表達量和感染前無顯著性差異。
　　本研究通過分子生物學(xué)手段獲得了半滑舌鰨補體 Cfi和C3-1的全長cDNA序列，分析了其氨基酸結(jié)構(gòu)，在獲得重組rCsCfi蛋白后，證明了其在體外具有抗菌活性，并能夠在生物體內(nèi)引起下游基因Cfh和C3-1表達量的變化。而在半滑舌鰨感染鰻弧菌后，能夠引起C3-1基因的特異性表達。本研究從生物學(xué)角度出發(fā)，為半滑舌鰨工廠化科學(xué)養(yǎng)殖的發(fā)展提供了一個可借鑒的方向，抗菌產(chǎn)品的開發(fā)，飼料添加劑的應(yīng)用對健康