膽管癌相關(guān)新基因FXYD6全長(zhǎng)cDNA克隆及其功能區(qū)定位分析、亞克隆與原核表達(dá).pdf

1、CCR-L2/FXYD6基因是本課題小組前期研究獲得的膽管癌相關(guān)新基因，F(xiàn)XYD6基因是FXYD基因家族中的一個(gè)新成員，全稱為包含F(xiàn)XYD氨基酸鏈的離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子成員6(FXYDdomain-containingiontransportregulator6)。已知FXYD基因家族蛋白產(chǎn)物功能與細(xì)胞膜的離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)有關(guān)，但其主要功能尚屬未知。作為膽管癌基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)，腫瘤相關(guān)基因的研究目前仍無突破性進(jìn)展。鑒于膽管細(xì)胞的許多重要功能調(diào)節(jié)與

2、細(xì)胞膜表面離子通道的功能有關(guān)，有必要對(duì)此開展深入研究。 本研究主要將生物信息學(xué)方法與分子生物學(xué)方法結(jié)合，從人組織cDNA文庫(kù)(肝、腦)獲得膽管癌相關(guān)的新基因FXYD6全長(zhǎng)序列，借助計(jì)算機(jī)蛋白質(zhì)分析軟件預(yù)測(cè)該基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)，首次設(shè)計(jì)了FXYD6基因信號(hào)肽剪切后功能區(qū)蛋白體外表達(dá)序列；并將其克隆到pGEM-T和pBV220表達(dá)載體上；繼而以大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)，使剪切后功能區(qū)蛋白在大腸桿菌中獲得了體外表達(dá)。主要內(nèi)容共分三部

3、分： 1、采用Touch-down多步驟退火PCR方法，從胎肝cDNA文庫(kù)、腦cDNA文庫(kù)克隆出FXYD6基因全長(zhǎng)cDNA序列，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)，但在脾cDNA文庫(kù)中未獲得目的基因； 2、利用NCBI網(wǎng)站提供的ORF識(shí)別系統(tǒng)(0RFFinder)以上述序列為模板進(jìn)行編碼區(qū)序列的識(shí)別，得到正相和反相各三種不同編碼順序的開放閱讀框架，主要功能區(qū)集中在+1相位67～354bp范圍內(nèi)；采用Goldkey軟件對(duì)可能性最大的+1相

4、位編碼區(qū)序列進(jìn)行分析，獲得該基因產(chǎn)物作為膜蛋白的可能功能區(qū)分布：其中信號(hào)肽位于第1～17aa，主要功能位點(diǎn)位于18～34aa，35～57aa為跨膜區(qū)肽鏈結(jié)構(gòu)，58～95aa是胞內(nèi)區(qū)，為潛在的功能位點(diǎn)，其中FHYD為FXYD基因家族的保守序列。 應(yīng)用Goldkey軟件分析、設(shè)計(jì)引物序列，在功能區(qū)堿基前添加起始密碼子ATG，在上下游序列兩端添加PstⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增出剪切掉信號(hào)肽序列的功能區(qū)片段(即包含18～95a

5、a的肽鏈段)，并將功能區(qū)序列亞克隆在pGEM-T載體，測(cè)序成功。 3、將目的片段重組入攜有PLPR啟動(dòng)子的表達(dá)載體pBV220，成功構(gòu)建pBV220/FXYD6-ex基因功能區(qū)重組表達(dá)質(zhì)?？寺?，并分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、HB101、BL21和JM109，采用熱誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)該基因功能區(qū)蛋白的體外原核表達(dá)，并探討不同宿主菌、不同誘導(dǎo)溫度對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)XYD6-ex基因功能區(qū)蛋白在大腸桿菌DH5α中表達(dá)量最高，目的蛋