模擬微重力下改良纖維蛋白凝膠復(fù)合軟骨細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：將經(jīng)過抑肽酶和氨甲環(huán)酸改良的纖維蛋白膠(FG)支架復(fù)合軟骨細(xì)胞，利用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀進(jìn)行軟骨細(xì)胞一支架復(fù)合物模擬微重力培養(yǎng)，觀察模擬微重力對軟骨細(xì)胞一改良纖維蛋白膠支架復(fù)合物在體外構(gòu)建的影響，了解改良支架材料的降解特性以及組織工程軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌的情況，觀察細(xì)胞、支架復(fù)合物在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的相關(guān)情況，探索模擬微重力下改良軟骨模塊修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的效用及其可能的臨床應(yīng)用價(jià)值。 研究方法： 一、動物體外實(shí)驗(yàn)部

2、分： 1．取3周齡新西蘭幼兔的關(guān)節(jié)軟骨制取軟骨細(xì)胞，體外單層培養(yǎng)擴(kuò)增，收集4代以內(nèi)的軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，種植于改良纖維蛋白膠支架上，構(gòu)建細(xì)胞改良纖維蛋白膠支架復(fù)合物。 2．將復(fù)合物分成兩組：旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組和普通對照組。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組利用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀進(jìn)行模擬微重力培養(yǎng)；普通對照組在24孔板中靜止培養(yǎng)，均連續(xù)在體外進(jìn)行三維立體培養(yǎng)、擴(kuò)增2周。觀察復(fù)合物大體情況，測量濕重；觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化，繪制細(xì)胞生長曲線，光鏡、掃描電鏡和透射

3、電鏡下的形態(tài)學(xué)觀察和組織學(xué)觀察(HE染色、阿利新藍(lán)染色)以及Ⅱ型膠原免疫組化檢測、氨基多糖(6A6)的測定，了解模擬微重力對改良纖維蛋白膠軟骨細(xì)胞復(fù)合物培養(yǎng)的影響。 二、動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分：將48只雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的3月齡新西蘭兔動物模型隨機(jī)分為四組。在A組、B組和C組的關(guān)節(jié)軟骨缺損中分別植入在模擬微重力下培養(yǎng)的細(xì)胞改良F6支架復(fù)合物、普通環(huán)境培養(yǎng)下的細(xì)胞改良F6支架復(fù)合物以及無細(xì)胞的單純改良FG支架，D組為空白對照組。術(shù)后第2

4、、6、12周取材，進(jìn)行大體評測，組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察，并觀察載體降解情況，于第12周標(biāo)本按照Wakirani標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織工程學(xué)評分，然后對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 研究結(jié)果： 一、體外實(shí)驗(yàn)部分： 1．經(jīng)體外培養(yǎng)1周和2周，兩組支架材料復(fù)合物基本保持了復(fù)合物的大小和形狀，濕重測定經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著差異。 2．改良支架的復(fù)合物經(jīng)體外培養(yǎng)2周，組織學(xué)及Ⅱ型膠原免疫組化檢測，顯示兩組均有大量軟骨細(xì)胞生成，細(xì)胞

5、周圍有酸性粘多糖沉積和特異性II型膠原表達(dá)，軟骨組織長勢良好。 3．普通培養(yǎng)組細(xì)胞倍增時(shí)間為5.1天，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組為4.7天。4．相對于普通培養(yǎng)組，模擬微重力能刺激軟骨細(xì)胞代謝，基質(zhì)的外分泌，Ⅱ型膠原和GAG的合成量均增加，GAG含量在第2周出現(xiàn)顯著性差異，顯示模擬微重力環(huán)境下培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞-改良纖維蛋白膠支架復(fù)合物質(zhì)量較好。 二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分： 1．術(shù)后第2周，A、B、C各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)可見種植的軟骨模塊，邊界清楚，與

6、周圍組織未融合，無一例種植塊脫落?？瞻捉M內(nèi)只見少許淤血塊。 2．術(shù)后第6周，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組可見不典型的透明軟骨組織，軟骨細(xì)胞位于陷窩中，細(xì)胞數(shù)量較多，排列較為規(guī)則，可見分區(qū)，阿利欣藍(lán)染色陽性基質(zhì)含量較高，局部可見少許淋巴細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨缺損部修復(fù)面約為正常軟骨的2/3-3/4，表面較為平整；普通培養(yǎng)組亦可見不典型透明軟骨組織，軟骨細(xì)胞位于陷窩中，細(xì)胞數(shù)量較多，排列不規(guī)則，阿利欣藍(lán)染色陽性基質(zhì)較前組為少，修復(fù)面平整，修復(fù)組織厚度大約

7、為鄰近軟骨的1/2-2/3；單純支架組為纖維組織覆蓋，表面凹凸不平，凹陷明顯，周圍邊界清楚，在單純支架組偶有類纖維軟骨形成，并有吞噬降解材料的巨噬細(xì)胞出現(xiàn)：在完全空白組表面可見一薄層組織敷蓋，主要為纖維疤痕及炎性組織敷蓋。 3．術(shù)后第12周，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組修復(fù)軟骨與鄰近軟骨整合緊密、厚度相近、細(xì)胞位于軟骨陷窩中，數(shù)量較正常軟骨為多，富含阿利欣藍(lán)染色陽性基質(zhì)，修復(fù)軟骨結(jié)構(gòu)與正常軟骨相似，表層細(xì)胞呈橢圓形，長軸與關(guān)節(jié)面平行，中間細(xì)胞呈圓

8、形，放射區(qū)內(nèi)細(xì)胞有柱狀排列趨勢；普通培養(yǎng)組亦可見部分透明軟骨組織，軟骨細(xì)胞位于陷窩中，細(xì)胞數(shù)量尚可，排列欠規(guī)則，阿利欣藍(lán)染色陽性基質(zhì)較前增多，修復(fù)面較為平整，部分修復(fù)組織厚度大約為鄰近軟骨3/4；單純支架組缺損區(qū)內(nèi)大部為纖維組織覆蓋，其下為軟骨下骨，修復(fù)組織與鄰近組織邊界較為清楚，表面不平，偶見軟骨細(xì)胞；完全空白組內(nèi)為松散的纖維疤痕組織敷蓋及部分炎性細(xì)胞的存在。 4．術(shù)后第12周按照Wakirani標(biāo)準(zhǔn)評分，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨效果由好

9、至差的順序?yàn)樾D(zhuǎn)培養(yǎng)組的細(xì)胞改良FG支架復(fù)合物組、普通培養(yǎng)組的細(xì)胞 改良FG支架復(fù)合物組、單純改良FG支架、空白對照組。評分通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組之間存在顯著性差異。 結(jié)論： 1．旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀提供的模擬微重力環(huán)境，可以使軟骨細(xì)胞高密度生長并能促進(jìn)其分泌基質(zhì)，從而提高了組織工程化軟骨的質(zhì)量。 2．經(jīng)過改良的纖維蛋白膠支架，其降解速率與軟骨組織基質(zhì)形成同步，能長時(shí)間支持體內(nèi)、外軟骨組織的形成，并適合旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，是軟骨組織工程