胰島素樣生長因子-1對背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元谷氨酸損傷的保護作用.pdf

1、胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）被認為是一種在體內(nèi)有廣泛表達并且作用復雜的多效能神經(jīng)營養(yǎng)因子，目前已知在離體培養(yǎng)的情況下，IGF-1對周圍神經(jīng)系統(tǒng)許多神經(jīng)元具有明顯的營養(yǎng)活性。IGF-1可以抑制多種因素引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的凋亡。 IGF-1對受刺激或損傷的背根神經(jīng)節(jié)（dorsalrootganglion，DRG）神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能的可塑性具有影響。IG

2、F-1能夠介導DRG神經(jīng)元的細胞內(nèi)事件，如神經(jīng)元突起內(nèi)線粒體的運輸或聚集以及細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化等。目前IGF-1對谷氨酸（glutamicacid，Glu）損傷的DRG神經(jīng)元的影響作用尚不清楚。本研究旨在觀察IGF-1對Glu損傷的DRG神經(jīng)元是否具有保護作用。 Glu是一種興奮性氨基酸遞質(zhì)，分布于哺乳動物的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。大量Glu釋放可過度激活突觸后膜的Glu受體-N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體，促使Ca2+

3、內(nèi)流，并激活下游的轉(zhuǎn)導信號，進而可以導致細胞凋亡。因此，本研究將原代分散培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元，用Glu（200μmol/L）造成神經(jīng)元損傷，觀察應(yīng)用IGF-1對體外培養(yǎng)神經(jīng)元損傷的保護作用。全文摘要如下： 本研究將原代分散培養(yǎng)的15d胎鼠DRG神經(jīng)元，在體外分散培養(yǎng)48h，然后將DRG神經(jīng)元分為3組：其中一組神經(jīng)元不施加任何干預因素，繼續(xù)培養(yǎng)，作為正常塒照組；另一組神經(jīng)元在培養(yǎng)液中加200μmol/L的Glu孵育，造成神經(jīng)元損

4、傷；第三組在加入200μmol/L的Glu的同時，加入10nmol/L的IGF-1繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，用倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察各組標本在不同時間的生長狀態(tài)。終止培養(yǎng)后，用微管相關(guān)蛋白2（microtubule associated protein2，MAP2）和4’，6二脒基-2-苯吲哚（4',6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）雙染DRG神經(jīng)元，并鑒定神經(jīng)元。對各組標本分別進行如下處理：用流式細胞儀檢測

5、細胞的凋亡率；用共聚焦激光掃描顯微鏡檢測各組神經(jīng)元胞體內(nèi)鈣離子熒光強度的變化，用Westernblot檢測caspase-3前體蛋白表達的變化。根據(jù)以上各項形態(tài)和功能檢測指標綜合分析IGF-1對Glu損傷的DRG神經(jīng)元的保護作用。 實驗結(jié)果如下： （1）MAP2和DAPI熒光雙染：可見MAP2和DAPI標記的細胞，絕大部分細胞為神經(jīng)元，僅見少數(shù)單染的非神經(jīng)元細胞。 （2）各組DRG神經(jīng)元倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察結(jié)果：正

6、常培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元突起明顯，突起互相交織形成網(wǎng)狀；Glu損傷的DRG神經(jīng)元簇狀聚集明顯，有的神經(jīng)元胞體腫脹，神經(jīng)元突起斷裂或變短甚至消失，甚至有皺縮成圓形的死細胞脫壁；保護組DRG神經(jīng)元接近于正常對照組細胞。 （3）各組DRG神經(jīng)元凋亡率檢測結(jié)果：Glu損傷組DRG神經(jīng)元細胞凋亡率與對照組細胞凋亡率相比顯著增高，而IGF-1保護組神經(jīng)元細胞凋亡率與Glu損傷組相比顯著降低。 （4）各組DRG神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子熒光強度的檢測

7、結(jié)果：Glu損傷組細胞內(nèi)鈣離子熒光強度明顯增強，且胞體著色強烈，IGF-1保護組細胞內(nèi)鈣離子的熒光強度與損傷組相比明顯減弱，僅見個別著色較強的受損細胞。正常對照組DRG神經(jīng)元胞體內(nèi)Fluo-3標記的鈣離子熒光暗淡、均勻；Glu孵育8h的DRG神經(jīng)元胞體內(nèi)鈣離子濃度顯著升高，熒光強度明顯增強；應(yīng)用IGF-1與Glu共同孵育的標本，細胞內(nèi)鈣離子著色的熒光強度比單純Glu孵育的神經(jīng)元明顯減弱。定量分析結(jié)果表明，Glu損傷組細胞內(nèi)鈣離子熒光強度

8、較對照組明顯增高，（P<0.001），IGF-1保護組細胞內(nèi)鈣離子熒光強度較Glu損傷組明顯降低，（P<0.001），IGF-1保護組DRG神經(jīng)元胞體內(nèi)鈣離子的熒光強度與正常對照組相比無顯著性差異（P>0.05）。 （5）Westernblot分析caspase-3前體蛋白表達的結(jié)果：IGF-1可以抑制Glu誘導的caspase-3前體蛋白的降解。 以上結(jié)果提示：IGF-1可阻止由Glu損傷所引起的體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元形