bFGF基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力影響的研究.pdf

1、1．兔BMSCs細(xì)胞成骨方向誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定
　　 目的: 探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中基因表達(dá)模式。方法: 抽取兔股骨遠(yuǎn)端骨髓，全骨髓貼壁法培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用條件培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，用RT-PCR的方法檢測ALP、OPN、collagen-Ⅰ、bFGF和OC基因的表達(dá)，并對BMSCs表面抗原CD44及ALP活性進(jìn)行鑒定。結(jié)果: 誘導(dǎo)培養(yǎng)后，OPN、、ALP、collagen-Ⅰ、OC、bFGF基因分別于第1

2、、2代細(xì)胞正常表達(dá)，BMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)第一代檢測抗原CD44陽性率達(dá)44.4%，ALP含量增高無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論: 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)中自原代到第2代逐漸向成骨細(xì)胞分化，成骨細(xì)胞特異性基因順序表達(dá)，已具備成骨細(xì)胞特征，此為進(jìn)一步探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化基因表達(dá)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 2．bFGF-慢病毒真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　 目的: 構(gòu)建攜帶人bFGF基因的慢病毒載體，構(gòu)建攜帶GFP基因

3、的慢病毒載體作為對照,分別轉(zhuǎn)染成骨方向誘導(dǎo)的BMSCs，鑒定bFGF和GFP基因的表達(dá)。方法: 設(shè)計(jì)人bFGF基因引物，用Trizol法提取胎盤組織RNA，用RT-PCR的方法擴(kuò)增出bFGF基因，連接至pLenti6/V5-D-TOPO? 表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ雙酶切和DNA測序證實(shí)質(zhì)粒正確構(gòu)建。在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 2000的介導(dǎo)下，bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表達(dá)質(zhì)粒同包裝質(zhì)粒pLP

4、1、pLP2、 包膜質(zhì)粒pLP/VSVG 共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞株，收集bFGF-慢病毒上清轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后第2代的兔BMSCs。設(shè)計(jì)GFP基因引物，以GFP-PMSLV-Plazmid為模板，PCR的方法擴(kuò)增出GFP基因，連接至pLenti6/V5-D-TOPO? 表達(dá)質(zhì)粒，GFP-慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染BMSCs過程同bFGF-慢病毒。RT-PCR方法檢測bFGF mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果: 轉(zhuǎn)染48小時后，對照組BMSCs可見綠色熒光蛋白