流感病毒H3N2亞型Vero細(xì)胞適應(yīng)株基因克隆及相關(guān)基因突變位點(diǎn)分析.pdf

1、20世紀(jì)末，病毒全基因組測序、生物信息學(xué)分析、蛋白質(zhì)組學(xué)和DNA芯片技術(shù)的發(fā)展為病毒研究領(lǐng)域帶來了前所未有的變革。應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和工具，可對現(xiàn)有的流感病毒序列進(jìn)化規(guī)律進(jìn)行研究。通過對病毒序列的分析，可以預(yù)測病毒的關(guān)鍵抗原位點(diǎn)或病毒突破宿主障礙的關(guān)鍵氨基酸殘基的變化。從而為傳統(tǒng)方法無法取得成功的疫苗研究帶來了希望。同時(shí)也可對病毒進(jìn)化過程中宿主障礙突破可能帶來的大流行提供預(yù)測和有力爭取預(yù)警時(shí)間。流感病毒疫苗生產(chǎn)現(xiàn)在存在許多需要改進(jìn)的方

2、面，比如使用雞胚生產(chǎn)流感疫苗的不利于應(yīng)對大規(guī)模流感爆發(fā)等問題。Vero細(xì)胞是WHO生產(chǎn)疫苗指定細(xì)胞，能夠利用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，在流感疫苗生產(chǎn)上有著廣闊的應(yīng)用前景。但Vero細(xì)胞不是流感病毒的天然易感細(xì)胞，因此建立流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的基因組并通過反向遺傳學(xué)技術(shù)制備生產(chǎn)毒株對于流感疫苗的生產(chǎn)具有重要意義。本試驗(yàn)使用流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株A/kunmin/1/2005va，設(shè)計(jì)帶有Esp3I或Ecol31I酶切位點(diǎn)的引物，

3、用RT-PCR擴(kuò)增A/kunming/1/2005va的8個(gè)基因全長片段，通過點(diǎn)突變將PB2基因中的兩個(gè)Ecol31I位點(diǎn)突變后將這八個(gè)基因片段分別連接至雙向表達(dá)載體PHW2000上，從而構(gòu)建了流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的基因組，為遺傳重配生產(chǎn)在Vero細(xì)胞上高產(chǎn)的流感病毒提供了可供選擇的基因庫。接著通過將A/Kunming/1/2005與A/kunming/1/2005va基因及編碼蛋白序列的比對，提供了病毒進(jìn)化的理論依據(jù)，對改造流感