結(jié)核分枝桿菌H37Rv分泌濾液中糖蛋白的篩選.pdf

1、目前，結(jié)核病仍然是威脅人類健康的主要傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年約有800萬人感染結(jié)核分枝桿菌，300萬人死于結(jié)核病。如何有效的預(yù)防和控制結(jié)核病是人類面臨的一個(gè)重要課題。通過對(duì)一些細(xì)菌的研究表明，細(xì)菌糖蛋白與細(xì)菌致病性密切相關(guān)。其作用包括：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性：細(xì)胞表面及胞內(nèi)識(shí)別；細(xì)胞粘附，調(diào)節(jié)及維持許多生化特征：如蛋白可溶性，粘度，表面電荷等。由于目前發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量有限，所以尋找和發(fā)現(xiàn)新的結(jié)核分枝桿菌糖蛋白，研究它們的功

2、能和合成途徑，對(duì)于全面了解結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制以及研制新的抗結(jié)核藥物或疫苗具有重要意義。 通過對(duì)天然結(jié)核分枝桿菌不同組份(包括細(xì)胞壁，細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)菌分泌液等)分別進(jìn)行研究檢測，發(fā)現(xiàn)只有在胞外分泌液(culture filtrateprotein，CFP)中有糖蛋白的存在。此外，通過研究結(jié)核分枝桿菌糖蛋白的合成機(jī)制發(fā)現(xiàn)，只有底物是經(jīng)過分泌途徑到達(dá)胞外的蛋白，才能在甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成糖基化蛋白，而細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白則不

3、能進(jìn)行糖基化。所以依據(jù)目前現(xiàn)有的理論，在進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌糖蛋白的篩選時(shí)，只選擇了CFP作為研究對(duì)象，而不選擇細(xì)胞的其它組份。 在生物安全3級(jí)操凈臺(tái)中，將50﹪甘油凍存的結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株接種到7H11瓊脂糖平板上，37℃孵箱中生長2周。挑取平板上單個(gè)菌落接種到10ml 7H9液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)2周。將10ml菌液再轉(zhuǎn)移到1L的GAS液體培養(yǎng)基中。接種后的細(xì)菌于37℃孵箱中以100rpm的速度振搖培養(yǎng)。約10-1

4、4天后，監(jiān)測細(xì)菌培養(yǎng)液OD<,600>值，當(dāng)細(xì)菌OD<,600>值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，取出培養(yǎng)瓶。4℃離心收獲上述細(xì)菌，轉(zhuǎn)數(shù)3000rpm，離心15mins，將沉淀的細(xì)菌再溶于100ml GAS培養(yǎng)基中(不含有土溫)，然后平均接種到10個(gè)各含有1L GAS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)于37℃孵箱中以100rpm振搖培養(yǎng)2周。2周后，停止培養(yǎng)，取出菌液，將培養(yǎng)瓶靜置，細(xì)菌沉淀，用50ml吸管于操凈臺(tái)中將細(xì)菌吸出，將余下的上清液經(jīng)0.2μmZa

5、pcap過濾器經(jīng)負(fù)壓吸引過濾除菌，用3個(gè)容積為4L的高壓滅菌的收集瓶收集濾液，得到粗提的CFP。于4℃冷庫中將約10L的CFP粗提液倒入Amicon容器中，打開氮?dú)夤揲y門，在持續(xù)的壓力作用下(最大壓力不能超過60 psi)，Amicon容器中的CFP會(huì)自動(dòng)緩慢流入到過濾濃縮裝置中，該裝置內(nèi)的磁力攪拌棒緩慢攪動(dòng)，防止有沉淀產(chǎn)生。此時(shí)，分子量大于3kDa的蛋白成分得到保留，而小的分子會(huì)被濾除，使粗提的CFP得到濃縮。大約48～72小時(shí)后，1

6、0L的CFP會(huì)濃縮到10～50ml左右。在此過程中，壓力保持一致，裝置接口處密閉。將濃縮的CFP轉(zhuǎn)移到透析袋(3kDa)中，于4℃冷庫中透析。透析液為8L的10mM的碳酸氫胺。每8h更換一次透析液，共更換3次。采用BioRad 680微板閱讀器(波長550 nm)BCA法檢測蛋白濃度。用ConA結(jié)合緩沖液將蛋白樣品CFP濃度稀釋到1mg/ml：ConA瓊脂糖4B樹脂裝柱，將10ml樣品緩慢加到柱內(nèi)，用5倍柱體積的ConA洗脫液洗脫柱上結(jié)

7、合的蛋白樣品，流速為1 ml/min；收集洗脫部分；將收集到的樣品放到透析袋(可截留分子量大于3.5kD的蛋白質(zhì))中，于4℃下透析，透析液為8L的10mM碳酸氫銨；每8小時(shí)更換一次透析液，共換3次；可以除去樣品中的糖和鹽。經(jīng)BCA檢測蛋白濃度。純化后的糖蛋白通過15﹪SDS-PAGE，將糖蛋白根據(jù)分子量的大小分離開來。通過考馬斯亮藍(lán)染色初步確定不同糖蛋白的分子量。記錄分子量大小，將6條蛋白條帶用刀片切下，并割成碎片，經(jīng)過脫色，抽提，最后

8、用測序級(jí)胰蛋白酶于37℃孵箱中過夜消化，離心取上清，經(jīng)真空干燥后加入質(zhì)譜上樣緩沖液，再次離心棄去沉淀部分，即用于質(zhì)譜分析。經(jīng)酶切消化的蛋白形成多肽或糖肽，首先采用高效液相色譜法將不同成分分離。色譜柱采用的C-18反相柱，可以根據(jù)極性的不同將多肽分開。自動(dòng)進(jìn)樣針每次取5μl樣品。流動(dòng)相包括緩沖液A(三氟乙酸：水=0.1∶99.9)和緩沖液B(三氟乙酸∶水∶乙腈=0.1∶9.9∶90)，流速：5ul/min，每次樣品進(jìn)樣5ul(緩沖液為5﹪

9、乙腈，95﹪雙蒸水，0.1﹪乙酸緩沖液)。梯度洗脫方案：流動(dòng)相首先為98﹪緩沖液A和2﹪緩沖液B，然后逐漸過渡到8﹪緩沖液A和92﹪緩沖液B。時(shí)間為1h。緩沖液pH值為7.4。質(zhì)譜儀為電噴離子阱質(zhì)譜儀，離子源電壓為4KV，CID為35﹪。采用軟件Xcalibur分析HPLC及己糖斷裂丟失情況。MS對(duì)蛋白糖基化的判斷主要是依據(jù)不同糖肽/多肽質(zhì)核比(m/z)之間的差值。而這個(gè)差值是由于糖分子的脫落以及離子化后分子攜帶的電荷的多少所決定的。由

10、于目前所發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌糖蛋白的糖基部分均為己糖，其分子量為162AMu(atomic molecular unit)。所以每失去一個(gè)糖分子，多肽的分子量將減少162；失去2個(gè)糖分子，分子量則減少324，依此類推……同時(shí)，由于HPLC分離的多肽片段在經(jīng)質(zhì)譜儀中的離子源電噴霧形成離子后，可以攜帶1，2，3，4等多個(gè)電荷，所以每一個(gè)帶有離子的多肽片段便會(huì)有其特征性的質(zhì)量電荷比，即朋歷。因此如果某一多肽被糖基化，在失去一個(gè)或多個(gè)糖分子后，不

11、同多肽之間的m/z的差值便是162<'*>n/z(n為失去糖分子的數(shù)量，z為電荷數(shù))，所以在質(zhì)譜圖上會(huì)規(guī)律性的出現(xiàn)m/z相差為162，81，54，40.5……的多肽峰。應(yīng)用軟件Xcalibur，分別在m/z減少為162、 81、 54、40.5的質(zhì)譜圖上挑選主要的峰，分析它們的MS，MS/MS(MS2)，MS/MS/MS(MS3)。采用軟件Bioworks，結(jié)合結(jié)核分枝桿菌蛋白數(shù)據(jù)庫分析，比對(duì)氨基酸序列，查找相應(yīng)的蛋白。實(shí)驗(yàn)中共收獲了9

12、.5L的CFP，經(jīng)過72小時(shí)的超濾濃縮，得到20ml CFP，經(jīng)透析后檢測蛋白濃度為1.2mg/ml。CFP經(jīng)ConA親和層析純化后，蛋白濃度為0.mg/ml。進(jìn)行SDS-PAGE電泳后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色顯示6條蛋白帶，相對(duì)分子量分別約75 kDa、65 kDa、47 kDa、26 kDa、16kDa、12kDa。盡管理論上經(jīng)ConA親和層析純化后的蛋白均應(yīng)為糖蛋白，但由于某些非特異性結(jié)合的蛋白可能混雜其中，需要采用HPLC-MS進(jìn)一步分

13、析。酶切后的樣品HPLC結(jié)果提示：基線平穩(wěn)，多肽均得到有效分離，色譜行為良好。應(yīng)用軟件Xcalibur及Bioworks分析質(zhì)譜結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在樣品12kDa、16kDa、65kDa、75kDa中，或者未發(fā)現(xiàn)己糖的脫落，即規(guī)律性減少的m/z(162、81、54、40.5)；或者即便有己糖的脫落，但未找到蛋白結(jié)構(gòu)。47kDa為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的糖蛋白ModD。只有26kDa為一可能的新的糖蛋白。應(yīng)用Xcalibur軟件逐個(gè)分析26kDa在HPLC

14、中的多肽峰，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為24.65 min的多肽片段總分子量為1467 AMU。經(jīng)MS/MS二級(jí)掃描，可見該多肽的m/Z逐級(jí)減少54(△54)的信號(hào)峰出現(xiàn)(1413．08→1359.19→1305.20)。經(jīng)MS/MS/MS三級(jí)掃描，仍可見m/z逐級(jí)減少54(△54)的信號(hào)峰出現(xiàn)(1359．54→1305.47→1251.04→1196.92→1142.92→1089.33→1034．96→981.18)。這說明在24.65min這一

15、時(shí)間點(diǎn)，出現(xiàn)了己糖從離子上脫落的現(xiàn)象，故該離子可能為單純的糖類或糖基化的多肽，需要進(jìn)一步尋找蛋白結(jié)構(gòu)的證據(jù)。采用Bioworks分析軟件，結(jié)合結(jié)核分枝桿菌蛋白數(shù)據(jù)庫，得到上述多肽的氨基酸序列為：HVPGHTGT：PASGDLASL，該多肽含有O連接的糖基化位點(diǎn)：即蘇氨酸(T)或絲氨酸(S)，而且在T或S的鄰近部位有脯氨酸(P)或丙氨酸(A)，這些均是0連接糖蛋白的特點(diǎn)。將上述氨基酸序列與結(jié)核分枝桿菌H3 7Rv蛋白數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列進(jìn)行

16、比對(duì)，發(fā)現(xiàn)可能的蛋白共有4個(gè)，分別為銅-鋅超氧化物歧化酶(superoxide dismutase cu-zn，SodC)；GltA2；Acn；未知蛋白。但是只有銅-鋅超氧化物歧化酶的結(jié)構(gòu)與上述多肽鏈結(jié)構(gòu)的相關(guān)性積分最高，其分子量為23.8kDa，與預(yù)期的26 kDa接近(蛋白數(shù)據(jù)庫中的蛋白分子量不包括糖苷部分)，而其他3個(gè)蛋白不僅相關(guān)性積分較低，而且分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于26 kD，因此，綜合上述分析，結(jié)核分枝桿菌蛋白銅-鋅超氧化物歧化酶(S

17、odC)應(yīng)是一個(gè)新的糖蛋白。目前結(jié)核分枝桿菌中糖蛋白發(fā)現(xiàn)的數(shù)量很少，對(duì)于其合成途徑以及功能的了解也非常有限，但是考慮到糖蛋白在真核生物以及其他細(xì)菌中的重要作用，人們普遍認(rèn)為發(fā)現(xiàn)和尋找新的結(jié)核分枝桿菌對(duì)于結(jié)核病的研究將具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用ConA結(jié)合HPL-MS/MS，找到了兩個(gè)糖蛋白，其中一個(gè)為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的糖蛋白modD，另一個(gè)為新的結(jié)核分枝桿菌糖蛋白即銅一鋅超氧化物歧化酶。盡管本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的糖蛋白數(shù)量不多，但是由于糖蛋白的鑒別非常困難