油茶炭疽病新病原遺傳結(jié)構(gòu)及其內(nèi)生拮抗菌定殖途徑研究.pdf

1、油茶炭疽病(Camellia oleifera anthracnose)是油茶主要病害之一，嚴重影響油茶品質(zhì)和產(chǎn)量。我們研究發(fā)現(xiàn)其主要的病原菌不止膠孢炭疽菌一種，其中新病原果生刺盤孢菌Colletotrichum fructicola分布廣泛、危害嚴重。本文開展了油茶炭疽病新病原果生刺盤孢菌鑒定和群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析;利用油茶內(nèi)生拮抗細菌Y13對C.fructicola進行盆栽苗防效實驗;利用綠色熒光蛋白基因標記誘變后的優(yōu)良油茶內(nèi)生拮抗細

2、菌Y13uv，研究其在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài)。主要研究成果如下:
　　(1)基于多基因系統(tǒng)發(fā)育分析的油茶新炭疽病原鑒定。對來自我國6個省市的油茶炭疽病樣本進行病原菌分離，通過形態(tài)學特征結(jié)合多基因譜系分析法構(gòu)建系了統(tǒng)發(fā)育樹。分離到能引起油茶葉炭疽病的病原菌共23株。多基因系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，這23株病原菌與模式菌株ICMP18581在內(nèi)的所有果生刺盤孢菌C.fructicola菌株序列聚為一個進化支，置信度高達100％。由此確定這23株

3、病原菌為果生刺盤孢菌C.fructicola。
　　(2)新炭疽病原果生刺盤孢菌C.fructicola群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。對來自我國10個不同地區(qū)的C.fructicola菌株群體遺傳結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)。根據(jù)ITS序列分析，這145個病原菌樣品可推導出13種單倍體型(haplotype);Haplotype5為優(yōu)勢單倍型，共有127個菌株。隨州湖北地理種群與其他種群遺傳分化極大，遺傳分化指數(shù)(FST)為0.14685-0.40385。經(jīng)AM

4、OVA分析顯示，種群間和種群內(nèi)的遺傳變異分別占總變異的13％和87％; Mantel測試顯示地理距離與遺傳分化沒有顯著的線性關系;該菌經(jīng)歷過種群擴張，群體間存在有效基因流。
　　(3)內(nèi)生拮抗細菌Y13定殖途徑研究。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將攜帶綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒導入枯草芽胞桿菌Y13uv細胞中，對菌株進行GFP標記;然后用標記菌株菌液經(jīng)灌根、噴葉、噴葉灌根結(jié)合三種方法分別處理油茶苗并定期回收，研究其在油茶體內(nèi)的定殖動態(tài)和途徑。統(tǒng)計

5、結(jié)果表明，標記菌株Y13uv-GFP能夠有效的通過油茶根部和葉部侵入油茶內(nèi)部，并在油茶植株體內(nèi)傳遞并定殖。
　　其中，灌根法處理后Y13uv-GFP隨著時間遞增向上傳遞，5d后基本可以在根部到莖中部位穩(wěn)定存在;根部的菌株數(shù)量在5d至15d趨于穩(wěn)定，20d后再次迅速減少，在30d時僅有0.53×103cfu/g。
　　噴葉法處理后莖上部位的定殖量卻明顯高于處于低物理高度部位的定殖量，通過葉部侵入的Y13uv-GFP有一定的向下

6、傳遞能力，但傳遞距離較短;Y13uv-GFP穩(wěn)定期為3d到10d，10d后各部位的定殖數(shù)量迅速下降。在30d從葉部可回收到0.40×103cfu/g的定殖量，與灌根法葉部30d的定殖量0.27×103cfu/g相差不大。
　　灌根噴葉結(jié)合法處理后，葉片中Y13 uv-GFP的定殖量出現(xiàn)了“先減后增”的趨勢，莖部定殖量在3-5d穩(wěn)定隨后減少，而根部則呈現(xiàn)遞減的趨勢。在綜合法處理30d后，根部定殖量為0.53×103cfu/g;葉部有