藍舌病病毒感染誘導(dǎo)細胞自噬的作用和機制.pdf

1、藍舌病(Bluetongue，BT)是由藍舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的一種重要蟲媒傳染病，可引起反芻動物特別是綿羊較高的發(fā)病率和致死率，對畜牧業(yè)的發(fā)展和畜產(chǎn)品的經(jīng)濟貿(mào)易造成潛在的巨大威脅。BTV屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬，是一種復(fù)雜的雙鏈分節(jié)段RNA病毒，擁有雙層衣殼，無囊膜。作為環(huán)狀病毒屬的一個典型代表，BTV在分子結(jié)構(gòu)、生化特征、流行病學(xué)和診斷方法等分子生物學(xué)領(lǐng)域已取得了重大進展，然而，BTV感染與宿主

2、細胞應(yīng)答之間的相互作用并沒有得到充分的關(guān)注，因此從宿主的角度去探索BTV的致病機制顯得尤為重要。
　　病毒作為一種專性細胞內(nèi)寄生物，其在感染過程中必定會與宿主的胞內(nèi)應(yīng)答發(fā)生相互作用。細胞自噬(Autophagy)作為一種保守的胞內(nèi)適應(yīng)性應(yīng)答，在維持細胞穩(wěn)態(tài)，促進新陳代謝方面起著舉足輕重的作用。它可將細胞內(nèi)的衰老細胞器、外源微生物等成分包裹在一個稱為自噬體的雙層膜結(jié)構(gòu)中，運送至溶酶體進行降解回收。自噬是對抗病原體的天然防御機制，但最

3、近越來越多的證據(jù)表明許多病毒已進化出多種策略抵抗、逃逸、甚至利用細胞自噬促進自身增殖，如流感病毒、丙型肝炎病毒、登革熱病毒、輪狀病毒等。對于BTV而言，其復(fù)制感染與細胞自噬之間的相互作用及其啟動機制便是本研究中要探索的問題。
　　首先，采用三種經(jīng)典方法對BTV1感染BSR細胞后是否誘導(dǎo)自噬進行了檢測，包括透射電鏡觀察自噬體的形成、激光共聚焦檢測熒光聚點的變化以及Western blot分析LC3的轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，與陰性對照相比，B

4、TV1感染后誘導(dǎo) BSR細胞產(chǎn)生了自噬體樣的雙層膜結(jié)構(gòu)，GFP-LC3熒光聚點顯著累積，而且LC3發(fā)生了明顯的類別轉(zhuǎn)化。此外，在BTV的自然宿主靶細胞-原代羊舌上皮細胞上進行了分析，得到了類似的結(jié)果。由此證實BTV1感染可以誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生。
　　其次，進行了基于自噬性降解的自噬潮分析。自噬潮，即自噬的整個動態(tài)連續(xù)的過程，可通過p62的降解、LC3-II的周轉(zhuǎn)、自噬體和溶酶體共定位分析等綜合評估。研究結(jié)果顯示，BTV1感染明顯促

5、進了自噬底物p62/SQSTM1的降解，而且溶酶體抑制劑CQ的配合使用導(dǎo)致了LC3-II和p62的蓄積，BTV1感染后自噬體標(biāo)記GFP-LC3和溶酶體標(biāo)記LysoTracker也出現(xiàn)明顯的共定位，表明BTV1誘導(dǎo)了自噬的起始和自噬性降解過程，即BTV1感染后觸發(fā)了完整的自噬潮反應(yīng)。
　　再次，判定BTV1誘導(dǎo)自噬是否嚴格依賴于病毒的有效復(fù)制。滅活病毒UV-BTV1不能誘導(dǎo)相同的自噬現(xiàn)象證實了該推論。進一步應(yīng)用自噬早期阻斷藥物3-M

6、A和晚期阻斷藥物CQ處理細胞或者干擾自噬關(guān)鍵基因Beclin1，可見自噬活性明顯降低，病毒復(fù)制也受到了顯著的抑制；相反，自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin處理細胞后激活了自噬反應(yīng)，促進了BTV1的復(fù)制。上述結(jié)果證明了BTV1的有效復(fù)制是誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵因素，并可以利用自噬促進自身增殖。
　　最后，為了深入探索BTV1感染激活自噬的機制，對可能涉及的多條信號級聯(lián)反應(yīng)進行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示，BTV1感染后明顯抑制了自噬的中央調(diào)控分子mTOR

7、的磷酸化及其下游底物p70S6K的活性，從而啟動了自噬。而后探索mTOR上游可能的調(diào)控信號，首先檢測發(fā)現(xiàn)BTV1感染激發(fā)細胞自噬不依賴于ERK1/2信號通路。而藥物處理和突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染顯示mTOR活性降低部分取決于PI3K/Akt的失活，相反，激活A(yù)kt后p-mTOR有所恢復(fù)，自噬也相應(yīng)被抑制，說明Akt信號通路參與了BTV1誘導(dǎo)的自噬的啟動過程。最為明顯的是AMPK途徑的影響，通過藥物處理和RNA干擾實驗等聯(lián)合使用，證實病毒感染顯著提高

8、了胞漿內(nèi)Ca2+的濃度，并介導(dǎo)了CaMKKβ的激活，作用于下游的AMPK，從而導(dǎo)致mTOR的抑制和自噬的激活。試驗進一步證實TSC2是Akt/AMPK及mTOR之間信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵中介分子。結(jié)果表明BTV1可通過抑制Akt和活化Ca2+介導(dǎo)的AMPK來共同作用于下游的TSC2-mTOR途徑，從而誘導(dǎo)自噬的激活，促進病毒自身的復(fù)制。
　　綜上所述，本研究首次闡明了BTV1感染誘導(dǎo)的細胞自噬在BTV1的復(fù)制中發(fā)揮著重要作用，而且系統(tǒng)分析