不同來源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在小鼠角膜移植排斥反應(yīng)中的作用.pdf

1、研究背景：
　　角膜移植手術(shù)是治療不可逆角膜盲的最重要手段，我國每年大約有3000例各種角膜疾病患者需要接受角膜移植手術(shù)。由于角膜赦免狀態(tài)的存在，在所有固體器官移植中，角膜移植是成功率最高的手術(shù)。即便如此，角膜移植術(shù)后植片的長期存活率并不令人滿意，排斥反應(yīng)的發(fā)生仍然無法避免。長期隨訪觀察結(jié)果表明，對于低危受體，移植后1年成功率高達(dá)90％，但10年后下降為60％～70％；而對于眼部有新生血管、嚴(yán)重化學(xué)燒傷多次移植失敗等高危病例，10

2、年后角膜移植成功率小于35％[107]。因此，進(jìn)一步深入了解角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制及其預(yù)防、治療方法，仍是眼科免疫領(lǐng)域的重要課題。
　　研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）廣泛存在于小鼠、大鼠、人的中樞和周圍免疫系統(tǒng)中，在維持體內(nèi)的免疫平衡，抑制器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病以及控制腫瘤的免疫治療中起著關(guān)鍵的作用。Treg細(xì)胞能夠有效抑制被某些自體抗原活化的CD4/CD8T淋巴細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體缺乏Treg時將會導(dǎo)致結(jié)腸炎，關(guān)節(jié)炎，

3、實(shí)驗(yàn)性腦脊髓膜炎，I型糖尿病等自身免疫性疾病；在同種異體移植模型中，也有報道Treg可抑制被供體抗原活化的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，延長移植物存活時間。盡管Treg已經(jīng)廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病、腫瘤以及器官移植的治療中，然而，在角膜移植領(lǐng)域，尤其是針對角膜移植排斥反應(yīng)，使用Treg誘導(dǎo)免疫耐受延長植片存活時間的相關(guān)研究還處于起步階段，國內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報道。
　　目的和內(nèi)容：
　　通過TGF?2-DC體內(nèi)誘導(dǎo)Treg及Treg過繼轉(zhuǎn)移

4、實(shí)驗(yàn)，對不同來源Treg細(xì)胞的表型、細(xì)胞因子表達(dá)、體內(nèi)作用機(jī)制以及抗原特異性進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期揭示Treg在角膜移植排斥反應(yīng)中的重要作用，進(jìn)一步深入了解角膜移植排斥反應(yīng)中Treg的作用機(jī)制，為臨床有效調(diào)控、治療角膜移植排斥反應(yīng)及其他自身免疫性疾病提供重要的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．Balb/c小鼠骨髓來源DC在含TGF-?2的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，與供體來源（C57BL/6小鼠）的可溶性抗原共孵育后分離純化。實(shí)驗(yàn)動物分別給予P

5、BS，2×106TGFβ2-DC尾靜脈注射，7天后采用免疫磁珠方法分離純化脾臟來源的表型為CD4+CD25+的Treg細(xì)胞。FACS分析不同來源Treg細(xì)胞表型和細(xì)胞因子水平；RT-PCR檢測Foxp3的表達(dá)。MLR檢測不同來源Treg在體外對活化CD4+CD25-T細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制情況，ELISA檢測Treg對活化T細(xì)胞細(xì)胞因子水平的調(diào)節(jié)作用。
　　2．分離純化正常小鼠來源Treg（nTreg）或TGFβ2-DC誘導(dǎo)的Treg（

6、iTreg），Balb/c小鼠分別給予PBS，106Treg靜脈注射，3天后進(jìn)行小鼠同種異體角膜移植術(shù)（C57BL/6小鼠）。移植后不同時間點(diǎn)手術(shù)顯微鏡下觀察植片存活時間及排斥曲線，移植后3天收集受體脾臟，F(xiàn)ACS分析活化CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量、表型變化及T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)；MLR檢測淋巴細(xì)胞增殖情況；ELISA檢測淋巴細(xì)胞分泌IL-2,IL-10,IFN-γ及TGF-β水平；采用特定中和性抗體（anti-IL-10、anti-TG

7、F-β）拮抗抑制性細(xì)胞因子，觀察Treg抑制作用的具體機(jī)制。
　　3．天然Treg或TGFβ2-DC誘導(dǎo)Treg免疫后的Balb/c小鼠接受C57BL/6小鼠來源的或無關(guān)第三方（C3H）小鼠來源的同種異體角膜移植術(shù)，移植后3天取受體脾臟T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，分別以C57BL/6、C3H小鼠脾細(xì)胞為刺激細(xì)胞，同時加入Treg共孵育。[3H]-TdR摻入法檢測細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果：
　　1．TGF-β2DC注射后能提高小鼠

8、脾臟中CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)數(shù)量（P<0.05）；其中CD25、CTLA-4、+Foxp3T細(xì)胞比例在iTreg組顯著提高，而CD28細(xì)胞比例顯著下降（P<0.05）。細(xì)胞因子方面iTreg組TGF-β表達(dá)較其他兩組明顯升高，提示TGF-β2DC誘導(dǎo)的iTreg可以促進(jìn)TGF-β的分泌。nTreg和iTreg組IL-10表達(dá)較CD25-T細(xì)胞組顯著升高（P＜0.05）?；旌狭馨图?xì)胞培養(yǎng)（MLR）結(jié)果顯示，iTreg對效應(yīng)T細(xì)胞增

9、殖反應(yīng)的抑制較其他組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2．天然Treg免疫抑制作用以細(xì)胞接觸機(jī)制為主，獲得性Treg兼顧了細(xì)胞接觸和抑制性細(xì)胞因子分泌兩種模式；獲得性Treg注射組分泌TGF-β的濃度水平明顯高于其他三組（P＜0.01），而TGF-β2DC組TGF-β水平無明顯改變，說明增多的TGF-β來自獲得性Treg細(xì)胞，而不是DC產(chǎn)生的。
　　3．CD4+CD25+T細(xì)胞可以成功獲得供體抗原特異性，獲取了供體抗原

10、特異性的獲得性Treg可以有效延緩植片排斥反應(yīng)的發(fā)生，MLR結(jié)果顯示獲得性Treg對供體抗原的抑制率(IR)為86.7％。
　　結(jié)論：
　　TGF-β2DC在體內(nèi)可以有效擴(kuò)增CD4+CD25+Tregs的數(shù)量及功能，不同來源Treg在細(xì)胞表型、細(xì)胞因子分泌等方面均有所不同。經(jīng)TGF-β2DC誘導(dǎo)產(chǎn)生、以間接方式獲取異體抗原特異性的Treg比天然Treg具有更強(qiáng)的抑制功能，可特異性抑制受體對供體抗原的免疫反應(yīng)，可以更有效地抑制