循環(huán)miR-185對(duì)臨床肝纖維化診斷價(jià)值的研究.pdf

1、研究背景:
　　 病毒性肝炎、酒精中毒、血吸蟲感染等導(dǎo)致的慢性肝病是我國(guó)最多發(fā)的常見病之一。慢性肝?。ㄖ饕锹圆《拘愿窝祝┑闹匾±砘A(chǔ)是肝纖維化。肝纖維化可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，患者病死率相當(dāng)高，生活質(zhì)量也相當(dāng)差。目前公認(rèn)，肝纖維化有時(shí)可以逆轉(zhuǎn)但肝硬化是難以逆轉(zhuǎn)。因此，面對(duì)慢性肝炎，一方面抗病毒仍是根本性治療，但另一方面，在抗病毒無特效治療的基礎(chǔ)上，另一重要的治療手段必須提上日程，即抗肝纖維化的早期診治。如能阻斷、減輕

2、乃至逆轉(zhuǎn)肝纖維化，就能在很大程度上改善各種肝病的預(yù)后，而肝纖維化的早期檢測(cè)是肝纖維化早期干預(yù)的前提。肝組織活檢是肝纖維化檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但作為有創(chuàng)檢測(cè)其臨床應(yīng)用尚難以廣泛開展。目前肝纖維化臨床診治困難，雖然常通過檢測(cè)血清HA、P111 P、C1V、LN等協(xié)助間接推測(cè)肝纖維化程度，但這些指標(biāo)不能早期準(zhǔn)確反映肝纖維化，故尋找準(zhǔn)確無創(chuàng)的早期肝纖維化檢測(cè)手段就十分必要和迫切。
　　 近年研究表明，miRNA這一轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控因子可通過

3、調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、脂代謝/脂肪酸代謝等一系列相關(guān)通路在許多肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用高通量芯片、RT-RCR等技術(shù)對(duì)動(dòng)物肝纖維化組織及臨床病人肝組織研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs在肝纖維化進(jìn)程中差異表達(dá)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)miR-199a，miR-199a*，miR-200a和miR-200b在CCL4肝纖維化動(dòng)物組織與人的肝纖維化組織中均差異性表達(dá)，并且與肝纖維化分級(jí)顯著相關(guān)。在HSC活化增殖進(jìn)程中確認(rèn)差異性表達(dá)的miR

4、NA有21種，miRNA的差異性表達(dá)與其活化增殖的發(fā)生密切相關(guān)，例如過表達(dá)的miR-29和miR-19b都可通過下調(diào)促纖維化因子的表達(dá)而抑制ECM合成。提示miRNA可能參與調(diào)控HSC生物學(xué)行為而影響肝纖維化的發(fā)生發(fā)展?？梢妋icroRNA在慢性肝病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中扮演重要角色，但可用于肝纖維化病理分級(jí)或早期診斷的血循環(huán)miRNA未見報(bào)道。
　　 microRNA被認(rèn)為是重要的傳遞細(xì)胞內(nèi)信息的循環(huán)核，在血液中有異常高的穩(wěn)定性，提

5、示循環(huán)miRNA分子可能成為無創(chuàng)診斷疾病的一個(gè)有效的方法。有人研究報(bào)道m(xù)iR-122和miR-155可能是丙肝患者炎癥介導(dǎo)的肝損傷標(biāo)志物。有人在慢性乙型肝炎患者血漿樣本中檢測(cè)了與肝病相關(guān)的9個(gè)miRNAs，發(fā)現(xiàn)3個(gè)(miR-199a、miR-125b和miR-122)的表達(dá)量的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中miR-122的變化最為顯著。提示血液中可能存在穩(wěn)定易檢測(cè)的miRNA，對(duì)于早期尚未明確診斷或晚期肝纖維化患者具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

6、　　 本課題擬通過檢測(cè)二甲基亞硝胺（Dimethylnitrosamine，DMN）誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠血液中miRNA表達(dá)譜，篩選肝纖維化進(jìn)程中外周血中差異表達(dá)的miRNAs，并在DMN和BDL大鼠肝纖維化模型中進(jìn)行驗(yàn)證，通過相關(guān)生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)分析，篩選出與肝纖維化相關(guān)的特異miRNAs;收集乙肝肝纖維化患者臨床血標(biāo)本，檢測(cè)目標(biāo)microRNA在HBV感染患者外周血樣本的表達(dá)，構(gòu)建ROC曲線，計(jì)算目標(biāo)microRNA對(duì)肝纖維化的

7、診斷的敏感度與特異度，分析目標(biāo)microRNA在肝纖維化中的診斷效率，即通過測(cè)定外周血microRNA的濃度來判定肝纖維化的程度，為肝纖維化早期檢測(cè)提供新的依據(jù)和方法，尤其在肝纖維化早期進(jìn)行定性定量監(jiān)測(cè)，可有效指導(dǎo)早期抗纖維化治療及其療效評(píng)估。
　　 第一部分:大鼠肝纖維化模型建立
　　 目的:建立DMN、BDL兩種大鼠肝纖維化模型，觀察大鼠的一般情況及大鼠肝臟病理組織學(xué)改變，對(duì)大鼠肝組織進(jìn)行分級(jí)分期，收集不同肝纖維化分

8、期的大鼠的外周血標(biāo)本，為下一步miRNA芯片篩選及PCR驗(yàn)證準(zhǔn)備。
　　 方法:DMN模型:對(duì)SD大鼠行DMN連續(xù)腹腔內(nèi)注射建立DMN大鼠肝纖維化模型，對(duì)照組給予腹腔注射同等劑量的生理鹽水;BDL模型:對(duì)SD大鼠膽總管肝門處上下結(jié)扎(bile duct ligated，BDL)，并從中間間斷，導(dǎo)致膽汁淤積，建立BDL膽汁淤積型肝纖維化模型。定期觀察大鼠一般情況改變并處死，處死大鼠前進(jìn)行戊巴比妥腹腔注射麻醉，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血到PA

9、XgeneTM Blood RNATube采血管中，上下顛倒混勻，常溫靜置4小時(shí)后，-20℃凍存;取肝組織進(jìn)行HE染色、Masson及VG特殊染色并進(jìn)行病理學(xué)觀察，判斷大鼠肝纖維化程度。
　　 結(jié)果:(1)隨著造模周期延續(xù)，大鼠一般情況都發(fā)生相應(yīng)改變:DMN模型組大鼠在各時(shí)間段活動(dòng)和排便減少，體毛密度和光澤度變差，體重及肝重均低于對(duì)照組;BDL模型組:大鼠的活動(dòng)和排便減少、體毛密度和光澤度變差，由于膽汁淤積導(dǎo)致體重及肝重增加;(

10、2) DMN造模早期由于炎癥大鼠肝臟較正常組稍大，后期肝纖維化肝硬化后肝臟體積則小于對(duì)照組、肝臟表面可呈灰黃色細(xì)顆粒狀;BDL造模組大鼠肝臟較正常組增大明顯，肝色澤變黃尤以肝門附近明顯（膽汁淤積），后期肝臟逐漸變韌，表面略顯粗糙、偶呈細(xì)顆粒狀;(3) HE染色及Masson、VG特殊染色觀察:對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，未見明顯變性;DMN模型組均可見肝細(xì)胞濁腫、變性及壞死，可見少量炎性細(xì)胞滲出，門管

11、區(qū)和小葉內(nèi)膠原纖維增生，形成纖維間隔、并最終可出現(xiàn)假小葉;BDL模型組可見膠原纖維增生（以門管區(qū)為主），同時(shí)門管處膽管也明顯增生，最終可形成膽汁淤積性肝硬化樣改變;(4)大鼠的外周血采集到PAXgeneTM Blood RNA Tube管（因采血管中內(nèi)含穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄性狀的添加劑，-20℃可保存50個(gè)月），可應(yīng)用于芯片檢測(cè)及后期的驗(yàn)證。結(jié)論:對(duì)SD大鼠行DMN連續(xù)腹腔內(nèi)注射可成功建立DMN大鼠肝纖維化模型;對(duì)SD大鼠膽總管肝門處上下結(jié)

12、扎，導(dǎo)致膽汁淤積，可成功建立BDL膽汁淤積型肝纖維化模型。根據(jù)病理分期分級(jí)，并將大鼠的血標(biāo)本進(jìn)行分組，可用于芯片檢測(cè)。
　　 第二部分:肝纖維化動(dòng)物模型外周血特異microRNAs的篩選及驗(yàn)證
　　 目的:研究外周血循環(huán)miRNAs在肝纖維化進(jìn)程中的差異表達(dá)情況，并在DMN及BDL大鼠肝纖維化模型外周血標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出肝纖維化相關(guān)的差異表達(dá)顯著的miRNAs，作為下一步臨床血標(biāo)本驗(yàn)證的目標(biāo)microRNA。

13、　　 方法:(1)根據(jù)前期肝纖維化組織病理分期結(jié)果選取DMN模型組中和BDL模型組中各級(jí)肝纖維化大鼠的血標(biāo)本，利用miRNA芯片初步篩選出在各級(jí)肝纖維化外周血循環(huán)中差異性表達(dá)的miRNAs;(2)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)目標(biāo)microRNA在DMN模型組中和BDL模型組中不同級(jí)別肝纖維化外周血中的表達(dá);(3)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站，進(jìn)一步挑選出在外周血循環(huán)中高豐度存在、且隨肝纖維化進(jìn)程顯著差異表達(dá)的miRNAs;(4)在DMN模型

14、組中和BDL模型組中不同級(jí)別肝纖維化外周血中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:(1) miRNA芯片分析結(jié)果表明，隨著肝纖維化發(fā)展，肝纖維化外周血循環(huán)中有37條miRNAs差異表達(dá)，其中miR-185上調(diào)水平最高，與對(duì)照組相比，表達(dá)水平增加最大，故選擇miR-185在DMN和BDL模型大鼠的外周血中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證;(2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示:miR-185在DMN肝纖維化模型外周血中隨肝纖維化進(jìn)程其表達(dá)量顯著增加;在早期肝纖維化(F1

15、/F2)和晚期肝纖維化(F3/F4)鼠例中分別升高4.15和5.87倍，晚期較早期miR-185表達(dá)量有所增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(3)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示miR-185在BDL肝纖維化模型外周血中隨肝纖維化進(jìn)程其表達(dá)量顯著增加;在早期肝纖維化(F1/F2)和晚期肝纖維化(F3/F4)鼠例中分別升高1.70和1.9倍，晚期較早期miR-185表達(dá)量有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(4) miR-185在DMN和BDL在兩種肝纖維化模型中表達(dá)量

16、變化趨勢(shì)一致，隨肝纖維化進(jìn)程其表達(dá)顯著增加，推測(cè)miR-185可作為肝纖維化的循環(huán)標(biāo)志物。
　　 結(jié)論:肝纖維化進(jìn)程外周血循環(huán)中存在miRNA差異性表達(dá)，miR-185在DMN和DBL兩種肝纖維化模型中的變化趨勢(shì)一致，隨肝纖維化進(jìn)程其表達(dá)顯著增加，miR-185可作為肝纖維化的循環(huán)標(biāo)志物
　　 第三部分:循環(huán)miR-185對(duì)臨床肝纖維化診斷價(jià)值的研究
　　 目的:芯片篩選及兩種動(dòng)物模型驗(yàn)證后，確定的miR-185

17、在乙肝肝纖維化患者外周血中進(jìn)行檢測(cè)，明確這miR-185在臨床診斷中的作用及價(jià)值。
　　 方法:(1)從福州軍區(qū)總院募集乙肝肝纖維化患者的外周血標(biāo)本;(2)利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-185在肝纖維化患者外周血中的表達(dá)水平;(3)統(tǒng)計(jì)這些已收集血標(biāo)本的臨床病人病歷，并根據(jù)其肝穿活檢的病理結(jié)果進(jìn)行分組;(4)結(jié)合金標(biāo)準(zhǔn)病理診斷及miR-185在臨床血樣本中的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，構(gòu)建ROC曲線，計(jì)算據(jù)miR-185值診斷不同肝纖

18、維化分期的特異度和敏感度，以ROC曲線下面積，明確這miR-185在肝纖維化臨床診斷中的作用及價(jià)值。
　　 結(jié)果:(1)在HBV感染患者的外周血中miR-185隨肝纖維化進(jìn)展其表達(dá)量顯著增加:在F0，F(xiàn)1/F2和F3/F4組中分別升高1.02、1.65和2.96倍，其中:在F0期（肝炎無肝纖維化）無顯著變化且無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;晚期較早期miR-185表達(dá)量有所增加且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可推測(cè)miR-185可能是肝纖維化累積的一個(gè)量化指標(biāo);

19、(2)24例中HBV晚期肝纖維化患者外周血中檢測(cè)miR-185的表達(dá)，按照病毒載量高低進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-185在不同病毒載量下的表達(dá)無顯著變化，P=0.9768，即miR-185在外周血中的表達(dá)與HBV感染及病毒載量的高低無關(guān);(3) miR-185診斷早期肝纖維化的ROC曲線下面積為0.8583(95％CI:0.7274-0.9726)，敏感度75％，特異度95.24％，P=0.0001276，可作為早期肝纖維化的診斷指標(biāo);(4)

20、miR-185診斷晚期肝纖維化的ROC曲線下面積為0.9395(95％CI0.8725-1.006)，敏感度87.5％，特異95.24％，P＜0.0001，可作為晚期肝纖維化的診斷指標(biāo);(5)晚期較早期miR-185表達(dá)量有所增加且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可作為鑒別早期和晚期肝纖維化的診斷指標(biāo)。
　　 結(jié)論:miR-185在HBV感染患者的外周血中隨肝纖維化進(jìn)展其表達(dá)量顯著增加，且表達(dá)量與HBV感染及病毒載量的高低無關(guān)，可通過測(cè)定外周血m