抑制腸源性內(nèi)毒素改善大鼠極限肝切除術(shù)預(yù)后的三重作用及機制.pdf

1、背景和目的:
　　肝切除術(shù)仍是臨床治療肝膽管腫瘤的最有效辦法。然而對于肝臟多發(fā)或者巨大腫瘤,常須擴大手術(shù)切除范圍。大范圍的肝切除術(shù)將導(dǎo)致一定數(shù)量的患者由于預(yù)留肝體積不足和感染等并發(fā)癥發(fā)生率的增高,其預(yù)后和腫瘤切除率均受到嚴(yán)重影響。以往研究者多將目光集中在如何充分利用肝臟再生潛能,加快肝再生速度以盡早恢復(fù)功能性肝體積和肝臟功能。然而,越來越多的證據(jù)表明,對于大范圍的肝切除術(shù)而言,肝切除術(shù)后早期過快的肝再生將無益于肝臟組織結(jié)構(gòu)的重建和

2、預(yù)后。因此,對于較大范圍的肝切除術(shù),必須通過對殘留肝臟細(xì)胞的充分保護,提供有利于肝臟多種細(xì)胞協(xié)調(diào)增殖的環(huán)境,防止肝臟免受細(xì)菌和代謝產(chǎn)物等物質(zhì)的損傷,才是避免發(fā)生肝功能衰竭、保證肝細(xì)胞增殖和肝臟組織結(jié)構(gòu)重建、改善術(shù)后肝功能和預(yù)后的關(guān)鍵。雖然對于肝切除術(shù)后感染并發(fā)癥已經(jīng)有了足夠的認(rèn)識和有效的預(yù)防、治療方法,然而,臨床上對于抑制腸源性內(nèi)毒素LPS(lipopolysaccharide)在大范圍肝切除術(shù)中的重要性并未給予充分重視,肝臟切除范圍的

3、大小也沒有成為衡量是否預(yù)防性應(yīng)用抗生素的標(biāo)準(zhǔn)。LPS作為革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分,能夠通過介導(dǎo)炎癥因子大量產(chǎn)生、增加腸粘膜通透性、降低血膽屏障功能等嚴(yán)重影響肝切除術(shù)后患者肝功能的恢復(fù)和預(yù)后。而在大范圍肝切除情況后,小肝綜合征、膽汁淤積致和門脈高壓的發(fā)生,使LPS生成、吸收增加,清除減少,又進一步促使肝臟和全身發(fā)生炎癥反應(yīng)的發(fā)生,最終使機體進入惡性循環(huán)狀態(tài),并很快導(dǎo)致肝功能衰竭和MODS。如能通過預(yù)防性應(yīng)用抗生素以控制腸道菌群、減少

4、LPS的產(chǎn)生和吸收,或?qū)⒂欣诟纳拼蠓秶吻谐g(shù)后患者的肝功能和預(yù)后,并提高對于肝臟多發(fā)腫瘤和巨大腫瘤的手術(shù)切除率。此外,抑制腸源性LPS的產(chǎn)生對大范圍肝切除術(shù)預(yù)后的保護作用及機制并不完全清楚。
　　在本實驗研究中,我們通過建立大鼠不同范圍肝切除術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化模型,探討不同范圍肝切除術(shù),特別是大范圍肝切除術(shù)(90％)后,大鼠血LPS和肝功能指標(biāo)等的變化。并于通過大鼠90%肝切除術(shù)圍手術(shù)期預(yù)防性抗生素(慶大霉素)的使用,抑制腸源性內(nèi)毒素

5、的產(chǎn)生,觀察術(shù)后大鼠血漿LPS水平變化,以及在LPS變化基礎(chǔ)上發(fā)生的包括肝臟血膽屏障、腸粘膜屏障、細(xì)胞增殖和凋亡等的一系列病理生理改變,進一步了解抑制腸源性LPS對大范圍肝切除術(shù)后病理生理改變的影響及可能機制,以求能夠通過預(yù)防性抗生素的應(yīng)用,抑制腸源性內(nèi)毒素,進而改善大范圍肝切除術(shù)患者的肝功能和預(yù)后,提高腫瘤切除率。
　　方法:
　　1.利用顯微外科技術(shù),建立大鼠不同范圍肝切除術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化模型。所有SD大鼠肝切除術(shù)均在乙醚麻醉下

6、經(jīng)固定、消毒、開腹后進行。70%肝切除術(shù)(PH),按順序切除左外葉、中葉;85%肝切除是在70%肝切除基礎(chǔ)上,再先后切除尾狀葉和右下葉;90%肝切除(極限肝切除術(shù))則是在70%肝切除基礎(chǔ)上,再行切除右下葉和右上葉;假手術(shù)組作為對照組,僅在乙醚麻醉下開腹后立即關(guān)閉腹腔。為了盡可能縮小差異,所有入肝管道均采用顯微外科技術(shù)于肝門部分離,套線結(jié)扎后離斷;除左外葉以外,所有肝靜脈均利用解剖位置采用肝實質(zhì)內(nèi)縫扎的方法離斷。盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)(CLP)用

7、以作為測定血漿LPS水平時的陽性對照。
　　2.實驗中首先探討了不同肝切除范圍大鼠病理生理和肝臟功能改變的差異。為了研究抑制腸源性LPS對大鼠90%肝切除術(shù)后肝功能和生存率等的影響,我們選擇對革蘭氏陰性菌有較強抑制作用的硫酸慶大霉素作為治療組用藥。又由于慶大霉素具有口服不易吸收的特性,給藥途徑我們采用插管灌胃的方式,以明確抑制胃腸道內(nèi)LPS的產(chǎn)生。硫酸慶大霉素5mg/ml,1ml,分別于大鼠90%切除術(shù)前1天、術(shù)后即刻、術(shù)后1天,

8、三次插管灌胃,共計15mg。
　　3.為了同時測定靜脈血和門脈血血漿LPS水平,對于實驗動物血液標(biāo)本的采集我們均采用乙醚麻醉下原腹腔切口開腹后,分別經(jīng)下腔靜脈和門靜脈取血,同時留取組織標(biāo)本后,乙醚過量吸入的方法處死大鼠。
　　4.我們運用免疫熒光、westernblot和Real-timePCR等實驗方法測定肝組織和腸粘膜緊密連接蛋白Occludin的表達,探討90%肝切除術(shù)后血膽屏障和腸粘膜屏障功能;并通過EGF、TLR-

9、4、PCNA、SOCS-3、Caspase3、iNOS等因子的測定,探討抑制腸源性內(nèi)毒素LPS對大鼠90%肝切除(極限肝切除)術(shù)后肝細(xì)胞增殖、凋亡的影響和機制。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立SD大鼠不同范圍肝臟切除標(biāo)準(zhǔn)化模型。
　　2.與其它組別相比大鼠90%肝切除組術(shù)后肝功能障礙更為明顯,表現(xiàn)為血清ALT、AST和TBIL水平明顯升高,ALB水平明顯降低。通過比較90%肝切除組大鼠與慶大霉素治療組大鼠肝功能我們發(fā)現(xiàn):

10、1.慶大霉素治療組大鼠術(shù)后1天、2天血ALT、AST和TBIL水平均明顯高于Sham組,ALB水平明顯低于Sham組;2.治療組術(shù)后1-3天大鼠血清ALT、AST和TBIL水平均明顯低于90%肝切除組(P≤0.01);3.治療組術(shù)后1天血清ALB與90%肝切除組相比并無顯著差異,術(shù)后2天和術(shù)后3天明顯高于90%肝切除組(＃P<0.01、*P<0.05),兩組術(shù)后5天與Sham組相比基本恢復(fù)正常。表示慶大霉素治療明顯改善大鼠90%肝切除術(shù)

11、后肝功能。同時治療組大鼠術(shù)后生存率明顯高于90%肝切除組,治療組術(shù)后7天生存率為60%,而SH組僅為20%。
　　3.鱟試劑法檢測大鼠血漿LPS水平,以CLP術(shù)后大鼠血LPS水平作為陽性對照。CLP組術(shù)后門靜脈及下腔靜脈血LPS水平較其余各組均顯著升高(＃P<0.01);PH組與Sham組相比無顯著差異;90%肝切除組大鼠術(shù)后門脈及靜脈血LPS水平明顯升高(＃P<0.01);治療組大鼠術(shù)后LPS水平也較術(shù)前明顯升高(P≤0.01)

12、,然而該組大鼠與90%肝切除組大鼠血LPS水平相比,術(shù)后1天治療組大鼠門脈血LPS明顯低于90%肝切除組(*P<0.05),而靜脈血LPS兩組間并無顯著差異,術(shù)后2天,治療組大鼠門靜脈和下腔靜脈血LPS水平均明顯低于90%肝切除組(＃P<0.01)。
　　4.免疫熒光和WesternBlot檢測肝臟及腸道緊密連接蛋白Occludin蛋白表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)90%肝切除后肝臟及腸道Occludin表達明顯下調(diào),提示血膽屏障和腸粘膜屏障

13、功能障礙。與血膽屏障功能障礙伴隨發(fā)生的是血TBA水平明顯升高。與此相比,治療組大鼠肝臟及腸道Occludin表達均明顯上調(diào),血TBA水平也明顯下降。Occludin表達水平與EGFmRNA表達水平在不同范圍肝切除比較中呈正相關(guān),即隨切除范圍的擴大,EGFmRNA和Occludin表達水平均下降,而慶大霉素抑制腸源性LPS所引起的Occludin表達上調(diào)也伴隨著肝組織EGFmRNA表達的上調(diào)。抑制腸源性內(nèi)毒素通過上調(diào)EGF的表達,而維持肝

14、臟及腸道緊密連接Occludin的表達,進而改善血膽屏障功能和腸黏膜屏障功能。
　　5.通過對肝組織PCNA的檢測發(fā)現(xiàn),90%肝切除術(shù)后早期發(fā)生了過激的細(xì)胞增殖反應(yīng),并影響到后期細(xì)胞的進一步增殖,慶大霉素抑制LPS減緩了術(shù)后早期的肝細(xì)胞增殖并有利于肝臟進一步的再生反應(yīng),表現(xiàn)為術(shù)后1天肝組織PCNA表達與90%肝切除相比明顯下調(diào),而術(shù)后2天即表現(xiàn)出較強的PCNA表達。這與LPS受體TLR-4及其下游肝細(xì)胞增殖抑制因子SOCS-3表達

15、水平有關(guān)。90%肝切除術(shù)后TLR-4表達首先下調(diào),意味著肝臟對LPS敏感性下降,TLR-4信號通路下游抑制性因子SOCS-3延遲表達,直到TLR-4表達上調(diào)(術(shù)后2天),SOCS-3才開始大量表達,進而抑制了肝細(xì)胞的進一步增殖。慶大霉素抑制LPS,能夠上調(diào)90%肝切除術(shù)后1天TLR-4表達水平,引起肝臟諸如IL-6等炎癥因子的大量產(chǎn)生,進而誘導(dǎo)SOCS-3表達上調(diào),以控制早期過激的肝細(xì)胞增殖反應(yīng),隨后SOCS-3表達的下調(diào),使肝細(xì)胞得以

16、有序持續(xù)增殖,直至恢復(fù)正常體積。
　　6.90%肝切除還伴有明顯的細(xì)胞凋亡反應(yīng),表現(xiàn)為20kDa大小左右的Caspase3活化片段表達的加強。這與LPS升高所引起的iNOS表達顯著上調(diào)有關(guān),90%肝切除術(shù)后肝組織iNOSmRNA表達顯著上調(diào)。慶大霉素抑制腸源性LPS能夠降低iNOS的表達水平,使Caspase3活化下調(diào),凋亡反應(yīng)減弱。即,90%肝切除大鼠肝組織iNOSmRNA表達明顯上調(diào),這將引起NO的大量產(chǎn)生,由于NO的產(chǎn)量與凋

17、亡相關(guān)因子表達密切相關(guān),NO的大量產(chǎn)生引起促凋亡因子的激活,表現(xiàn)為Caspase3活化加強,最終細(xì)胞凋亡明顯加強。而抑制LPSnengshi能使大鼠肝組織iNOSmRNA表達與90%肝切除組相比明顯下調(diào),Caspase3活化也受到抑制,凋亡反應(yīng)減弱。
　　結(jié)論:
　　1.深入研究不同范圍肝切除術(shù)后肝臟、腸粘膜等器官臟器發(fā)生的病理生理變化和機制必須建立在不同范圍標(biāo)準(zhǔn)化肝切除模型的基礎(chǔ)上。由于目前報道的大鼠肝切除術(shù),特別是大鼠9

18、0%肝切除術(shù),其手術(shù)操作方式復(fù)雜且多種多樣,并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),其后續(xù)研究也都建立在各自所建肝切除模型之上,導(dǎo)致研究所獲得的包括肝臟功能和生存率等結(jié)果均有很大差別。這也是導(dǎo)致對于不同范圍肝切除大鼠術(shù)后的病理生理過程和具體機制研究較少的原因之一。為此,必須首先通過規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化大鼠不同范圍肝切除手術(shù)方式和方法,建立了標(biāo)準(zhǔn)化的大鼠不同范圍肝切除模型,以避免對大鼠進行不同范圍肝切除術(shù)時由于手術(shù)操作方式的不同所造成的差異,使我們能夠以此為模型探討不同

19、范圍肝切除術(shù)后大鼠肝臟和機體發(fā)生的病理生理改變和可能的相關(guān)機制,進一步深入認(rèn)識臨床上不同范圍肝切除患者術(shù)后可能發(fā)生的病理生理過程。研究中我們主要利用血管鑄型和顯微外科技術(shù),精確、詳細(xì)且具體的對手術(shù)方式加以規(guī)范,以盡可能的減少誤差。根據(jù)實驗室前期大鼠肝臟血管鑄型實驗結(jié)果,在充分了解了大鼠門靜脈、肝動脈、肝靜脈和膽管系統(tǒng)等重要解剖結(jié)構(gòu)后,嚴(yán)格遵守操作原則,規(guī)范手術(shù)方法和步驟,特別是通過采用顯微外科技術(shù),精確的對大鼠肝門部和肝實質(zhì)內(nèi)門靜脈和肝

20、靜脈等重要結(jié)構(gòu)進行處理,盡可能的縮小了手術(shù)操作和方法對于不同范圍肝切除產(chǎn)生的差異,成功建立和規(guī)范了大鼠不同范圍肝切除標(biāo)準(zhǔn)化模型的方法,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。模型穩(wěn)定性通過肝切除術(shù)后肝功能指標(biāo)加以驗證。
　　2.大鼠不同范圍標(biāo)準(zhǔn)化肝切除模型方法建立成功,各實驗組樣本之間差異小,且肝臟功能惡化程度以及術(shù)后血內(nèi)毒素水平均與切除范圍相關(guān)。該部分結(jié)果表明,隨著肝切除范圍的擴大,ALT、AST、TBIL和ALB等肝功能指標(biāo)惡化更為明顯。在70