γδT細胞抗結(jié)核菌感染機制的研究.pdf

1、結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，由T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫對結(jié)核病的發(fā)病、演變及轉(zhuǎn)歸有決定性影響。γδT細胞作為連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的T淋巴細胞，在抗結(jié)核菌感染中發(fā)揮重要作用。γδT細胞表面的γδT受體(γδTCellReceptor，γδTCR)和自然殺傷細胞活化型受體2D(Naturalkillergroup2memberD，NKG2D)介導(dǎo)γδT細胞的抗感染過程。作為這些受體的配體，結(jié)核菌的蛋白抗原和被結(jié)核菌感染的細

2、胞表面應(yīng)激分子激活了γδT細胞的抗結(jié)核免疫反應(yīng)。但是，γδT細胞通過γδTCR識別結(jié)核菌抗原，并通過NKG2D識別被結(jié)核菌感染細胞上的UL16結(jié)合蛋白(UL16bindingprotein，ULBP)分子，從而將天然免疫和適應(yīng)性免疫連接起來抵抗結(jié)核菌感染的機制尚未完全澄清。
　　 本實驗室前期的研究結(jié)果表明,γδT細胞很可能通過γδTCR的互補決定區(qū)3（Complementarydeterminingregion3，CDR3）識

3、別結(jié)核菌蛋白Rv1194c，所以，我們對該蛋白進行原核重組表達，來研究γδT細胞通過γδTCR識別結(jié)核菌抗原的機制。同時，我們建立了鼠類ULBP樣轉(zhuǎn)錄本1(MurineULBP-liketranscript1，MULT1)轉(zhuǎn)基因小鼠，擬通過過量表達ULBP的類似物MULT1，來研究γδT細胞識別ULBP的機制。考慮到結(jié)核菌以慢性感染為主的特點和γδT細胞在體外不能長期存活的局限，我們決定對γδT細胞進行永生化培養(yǎng)，以期得到生長期限延長的

4、γδT細胞，而便于在體外研究機體在抗結(jié)核菌慢性感染的過程中γδT細胞所起的長期作用。
　　 本文有三部分研究內(nèi)容：結(jié)核菌重組蛋白的原核表達和鑒定，兩個品系轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代和鑒定，人γδT細胞的永生化。本文的科學(xué)意義在于：獲得了對人γδT細胞有擴增作用的結(jié)核菌蛋白、獲得了穩(wěn)定傳代的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和生長時限延長至50天的人γδT細胞，從而為后續(xù)研究人γδT細胞抗結(jié)核菌感染的機制打下了基礎(chǔ)。
　　 為闡明γδT細胞通過其受體γ

5、δTCR識別結(jié)核菌蛋白而介導(dǎo)抗結(jié)核菌感染的機制，我們對結(jié)核菌H37Rv株重組蛋白Rv1194c進行了原核表達和鑒定。在設(shè)計引物和得到模板后，我們通過聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction，PCR)獲得了目的基因擴增產(chǎn)物。檢測基因序列正確后，我們將目的基因連接表達載體并轉(zhuǎn)化表達菌株，最后使用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropy1β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)表達。對表

6、達產(chǎn)物鑒定后，我們對目的蛋白的可溶部分和包涵體部分進行了提取純化并初步研究了蛋白的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，天然狀態(tài)下提取的包含目的蛋白的可溶性蛋白混合物能夠刺激人外周血單個核細胞(Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)中的γδT細胞擴增。
　　 為闡明γδT細胞通過其受體NKG2D識別被結(jié)核菌感染細胞所表達的ULBP等分子的機制，我們建立了Multl/MultlS轉(zhuǎn)基因小鼠模型（MULT1為人類ULBP

7、分子在小鼠中的類似物），旨在通過過度表達MULT1/MULTS，來觀察兩種轉(zhuǎn)染基因Multl/MultlS在組織中的表達及其對免疫系統(tǒng)的影響，以了解它們與γδT細胞受體NKG2D結(jié)合，并介導(dǎo)γδT細胞抗結(jié)核菌感染的機制。通過將雄性的轉(zhuǎn)基因小鼠與雌性的野生型小鼠合籠，并且對這些小鼠的后代進行基因型鑒定，我們獲得了穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)基因小鼠用于后續(xù)實驗。
　　 為研究γδT細胞在機體漫長抗結(jié)核菌感染中的長期作用，需得到能夠在體外長期存活的

8、γδT細胞。我們用電轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法將人類γδT細胞進行永生化。在成功構(gòu)建了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基基因(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)重組表達載體pRevTRE-hTERT之后，我們對γδT細胞分別進行了電轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，然后加入強力霉素誘導(dǎo)hTERT基因表達，從而使γδT細胞永生化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人γδT細胞的存活期限延長至50天。其間，我們對電轉(zhuǎn)染條件進行了優(yōu)化，獲得了

9、穩(wěn)定產(chǎn)毒的細胞陽性克隆。
　　 綜上所述，本研究主要取得了如下結(jié)果：
　　 1．獲得了結(jié)核菌H37Rv株重組蛋白Rv1194c的原核表達產(chǎn)物，并初步發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物對人γδT細胞有擴增作用。
　　 2．獲得了16只MultlS陽性和5只Multl陽性的雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠用于后續(xù)研究。
　　 3．獲得了生長時限延長至50天的人γδT細胞，積累了人γδT細胞永生化的經(jīng)驗。
　　 我們通過表達結(jié)核菌重組保守蛋白