EBV-LMP1介導(dǎo)SPLUNC1調(diào)節(jié)miR-141-PTEN通路影響鼻咽癌細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)制.pdf

1、[研究背景]
　　 研究發(fā)現(xiàn)DNA腫瘤病毒中有些病毒的編碼產(chǎn)物能與宿主細(xì)胞內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞分化的蛋白結(jié)合，使其失活而發(fā)揮致瘤作用。EBV(Epstein-Barr virus，EBV)可能也具有此作用。我室克隆得到的鼻咽組織相關(guān)的特異性表達(dá)基因(nashopharynix associated specific，NASG)，即短腭、肺及鼻咽上皮克隆(Short Palate，Lung and Nasalepitheliu

2、m Clone1，SPLUNC1)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)組織及細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，是一個(gè)潛在的鼻咽癌抑瘤基因，初步研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1能促使感染EBV的細(xì)胞裂解，啟動(dòng)補(bǔ)體途徑和抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity,ADCC)作用對(duì)EBV進(jìn)行清除，并能通過(guò)抑制EBV關(guān)鍵基因潛伏膜蛋白1(Latent membrane

3、 protein1，LMP1)的表達(dá)降低EBV的致瘤能力。miRNA芯片篩查發(fā)現(xiàn)miR-141能受到SPLUNC1的調(diào)控。生物信息學(xué)分析顯示第10號(hào)染色體丟失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)為miR-141的靶基因。那么SPLUNC1能否通過(guò)miR-141調(diào)控PTEN及其下游信號(hào)通路呢？EBV對(duì)SPLUNC1的表達(dá)

4、會(huì)有影響嗎？
　　 本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)EBV與SPLUNC1之間的相互影響進(jìn)行探討，并明確SPLUNC1是否通過(guò)miR-141調(diào)控了PTEN及其下游絲蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase，Akt)信號(hào)通路，探索EBV整合入細(xì)胞后是否影響SPLUNC1及受其調(diào)控的miR-141-PTEN-Akt信號(hào)通路，以期為EBV的致瘤機(jī)制和SPLUNC1發(fā)揮抑瘤作用的信號(hào)通路增添新的一筆。
　　 [S

5、PLUNC1抑制整合入細(xì)胞內(nèi)的EBV關(guān)鍵基因表達(dá)的同時(shí)SPLUNC1自身表達(dá)受損]
　　 由于EBV不能直接感染上皮細(xì)胞，因此我們采用共培養(yǎng)的方式使細(xì)胞感染EBV。將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)SPLUNC1的HNE2細(xì)胞和空白對(duì)照HNE2/GFP與B95-8細(xì)胞（能產(chǎn)EBV）共培養(yǎng)24小時(shí)，隨后采用補(bǔ)體激活的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)去除B95-8細(xì)胞并通過(guò)擴(kuò)增猿猴特異性基因CAJA-DRBI明確B95-8細(xì)胞是否清除干凈;結(jié)果顯示:整合入過(guò)表達(dá)SPLUNC

6、1的細(xì)胞內(nèi)的EBV關(guān)鍵基因EBER、BZLF、LMP1表達(dá)明顯低于空載體組;HNE2/SPLUNC1細(xì)胞在第1天細(xì)胞接觸EBV時(shí)，細(xì)胞會(huì)應(yīng)激性地增加SPLUNC1的表達(dá)以抵抗病毒的侵入，但是在病毒整合入細(xì)胞后第2天、3天、5天、7天、9天，細(xì)胞內(nèi)SPLUNC1的表達(dá)會(huì)逐漸降低，并不能恢復(fù)到細(xì)胞感染病毒前水平。以上結(jié)果證實(shí)SPLUNC1能抑制整合入細(xì)胞內(nèi)的EBV關(guān)鍵基因的表達(dá)，與此同時(shí)EBV整合入細(xì)胞后也能抑制SPLUNC1的表達(dá)。

7、>　　 [SPLUNC1通過(guò)miR-141調(diào)控PTEN-Akt信號(hào)通路影響NPC細(xì)胞的增殖和凋亡]
　　 miRNA芯片顯示miR-141受到了SPLUNC1的調(diào)控。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)鼻咽癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)SPLUNC1能降低miR-141的表達(dá)，siRNA瞬時(shí)干擾SPLUNC1的表達(dá)后，miR-141表達(dá)明顯增高;且miR-141的表達(dá)與細(xì)胞分化程度和惡性程度相關(guān)。通過(guò)顯微切割獲得純化后的NPC組織和正常鼻咽上皮(normal na

8、sopharyngeal epithelium，NPE)組織，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SPLUNC1在NPC組織中的表達(dá)明顯比NPE組織要低，而miR-141在NPC組織中的表達(dá)明顯比NPE組織要高，兩者的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　 生物信息學(xué)分析顯示PTEN為miR-141的靶基因。于是我們將 miR-141的mimics及inhibitors轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞和NPC細(xì)胞系，檢測(cè)PTEN的表達(dá)情況。結(jié)果顯示miR-141的mimic

9、s能顯著減少PTEN的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染miR-141的inhibitor后細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)明顯增加;檢測(cè)NPE和NPC組織中PTEN的表達(dá)時(shí)，也顯示PTEN在NPC組織中的表達(dá)明顯低于NPE，NPC組織中PTEN和miR-141的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　 既然miR-141受到SPLUNC1的調(diào)控，PTEN是miR-141的靶基因，那么SPLUNC1能否調(diào)控PTEN的表達(dá)。通過(guò)過(guò)表達(dá)SPLUNC1和加入全反式維甲酸來(lái)增加NPC細(xì)胞

10、SPLUNC1的表達(dá)，證實(shí)SPLUNC1表達(dá)增加后，PTEN的表達(dá)也增加了;同時(shí)免疫熒光檢測(cè)顯示SPLUNC1并不影響PTEN在細(xì)胞內(nèi)的分布。干擾SPLUNC1的表達(dá)又可明顯下調(diào)PTEN的表達(dá)。隨后在過(guò)表達(dá)SPLUNC1的NPC細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入miR-141的mimics，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-141的mimics可部分抑制SPLUNC1上調(diào)PTEN的表達(dá)。其結(jié)果說(shuō)明SPLUNC1除了通過(guò)miR-141影響PTEN外，還可能通過(guò)其它通路來(lái)影響PT

11、EN的表達(dá)。
　　 PTEN參與細(xì)胞增殖和凋亡的信號(hào)通路主要是通過(guò)Akt信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。因此我們檢測(cè)了NPC細(xì)胞過(guò)表達(dá)SPLUNC1后對(duì)Akt信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SPLUNC1能明顯抑制p-Akt的表達(dá)，干擾SPLUNC1后p-Akt的表達(dá)則明顯增加，說(shuō)明SPLUNC1能通過(guò)PTEN影響Akt的磷酸化和活化。通過(guò)采用PTEN的抑制劑BPV處理過(guò)表達(dá)SPLUNC1的細(xì)胞系，證實(shí)SPLUNC1還能夠部分拮抗PTEN的抑制劑

12、BPV對(duì)細(xì)胞Akt信號(hào)通路的影響。
　　 隨后我們又通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)過(guò)表達(dá)SPLUNC1能將細(xì)胞周期阻滯在G1期;SPLUNC1能上調(diào)p27蛋白的表達(dá)，下調(diào)cyclin D和cyclin E、CDK2蛋白的表達(dá);同時(shí)還發(fā)現(xiàn)SPLUNC1能拮抗BPV的促增殖和抗凋亡作用。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)過(guò)表達(dá)SPLUNC1能通過(guò)調(diào)控PTEN-Akt通路抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制裸鼠移植瘤的形成。
　　 [EBV/LMP1

13、與SPLUNC1相互影響共同調(diào)控miR-141-PTEN-Akt信號(hào)通路]
　　 LMP1被廣泛認(rèn)為是EBV基因組中的重要致瘤基因。通過(guò)應(yīng)用過(guò)表達(dá)LMP1的正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69-LMP1，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)LMP1高表達(dá)時(shí)SPLUNC1的表達(dá)極低，miR-141的表達(dá)則較高，引起PTEN表達(dá)降低而激活A(yù)kt信號(hào)通路。但NP69-LMP1細(xì)胞過(guò)表達(dá)SPLUNC1后，LMP1的表達(dá)明顯被抑制，并上調(diào)PTEN的表達(dá)而抑制Akt通路的激活

14、。結(jié)果說(shuō)明LMP1能通過(guò)抑制SPLUNC1進(jìn)而影響miR-141-PTEN-Akt-路，但恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)SPLUNC1的表達(dá)又能抑制LMP1的表達(dá)，并增加PTEN的表達(dá)，從而導(dǎo)致下游Akt通路的失活。
　　 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)SPLUNC1能與EBV存在相互影響;SPLUNC1可通過(guò)下調(diào)miR-141上調(diào)PTEN的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)性調(diào)控Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制NPC細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)NPC細(xì)胞凋亡;EBV/LMP1可通過(guò)抑制SPLUNC1的