蛙皮素對(duì)下丘腦和海馬神經(jīng)元的作用研究.pdf

1、目的：蛙皮素(Bombesin),是一種腦腸肽,由14個(gè)氨基酸殘基組成,對(duì)飲食和行為具有調(diào)節(jié)作用。在哺乳動(dòng)物中,它的同類物有胃泌素釋放激素(gastrin-releasingpeptide,GRP)和神經(jīng)介素B(neuromedin B,NMB)。作為一種腦腸肽,蛙皮素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、缺血及學(xué)習(xí)記憶都具有良性作用。有研究表明在帕金森病人腦內(nèi)蛙皮素濃度增加,具有內(nèi)源性抗癲癇作用。此外還有很多實(shí)驗(yàn)表明蛙皮素具有神經(jīng)保護(hù)作用。下丘腦弓形核(a

2、rcuate nucleus,ARC),是成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)能量平衡調(diào)節(jié)的重要區(qū)域。弓形核內(nèi)的神經(jīng)肽Y(neuropipte Y,NPY)神經(jīng)元具有增加飲食的作用。本文使用NPY-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠,研究蛙皮素對(duì)于下丘腦弓形核內(nèi)NPY神經(jīng)元的作用及其可能機(jī)制。另外,還探索了蛀皮素對(duì)于腦缺血引起的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用及其對(duì)于大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元離子通道的作用,從而進(jìn)一步提供了蛙皮素神經(jīng)保護(hù)作用的證據(jù)。
　　 方法：第一部分:選取N

3、PY-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠,NPY神經(jīng)元中綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)的表達(dá)由免疫組織化學(xué)和單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄PCR(single-cellreverse transcription-PCR)確認(rèn)。運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),研究小鼠下丘腦腦片NPY神經(jīng)元的電生理特性。首先觀察蛙皮素對(duì)NPY神經(jīng)元興奮性的影響,然后觀察蛙皮素對(duì)于NPY神經(jīng)元串聯(lián)電阻,反轉(zhuǎn)電位的作用,最后在不同內(nèi)外液條件下觀察蛙皮素對(duì)NPY神經(jīng)

4、元的作用,來(lái)闡明蛙皮素對(duì)NPY神經(jīng)元的作用機(jī)制。除此之外,我們還使用了蛙皮素家族的肽類(NMB和GRP)以及其他與飲食有關(guān)的肽類,比較了不同肽類對(duì)NPY神經(jīng)元的作用。最后,還觀察了蛀皮素對(duì)阿黑皮原(proopiomelanocortin,POMC)神經(jīng)元的作用,與其對(duì)NPY神經(jīng)元的作用進(jìn)行比較。第二部分:選取18只成年Wistar大鼠,隨機(jī)分成正常組、缺血組和缺血后蛙皮素干預(yù)組。用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎的方法制作大鼠全腦缺血模型,使用Morr

5、is水迷宮和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)記錄的方式來(lái)研究蛙皮素對(duì)缺血引起的學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。然后使用幼年Wistar大鼠,制作海馬腦片,用膜片鉗中的電壓鉗技術(shù)研究蛙皮素對(duì)鈉離子通道的作用。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Student f檢驗(yàn)或ANOVA等統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05表示存在顯著性差異。
　　 結(jié)果：⑴從弓形核中收獲單個(gè)GFP陽(yáng)性神經(jīng)元后,運(yùn)用單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)觀察GFP陽(yáng)性神經(jīng)元中含有NP

6、Y編碼的mRNA,從而證明NPY-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠系建立成功。⑵蛙皮素(25011M)使NPY神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率增加了61.5±14.2％(n=15,P<0.05),使神經(jīng)元的膜電位去極化5.0±0.5 mV(n=15,P<0.05)。⑶NMB(250nM)使NPY神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率增加66.5±10.6％(n=16,P<0.05),使神經(jīng)元的膜電位去極化5.6±0.4 mV(n=16,P<0.05)。GRP(250nM)使NPY神經(jīng)元

7、動(dòng)作電位頻率增加9.2±10.5％(n=13,P>0.05),使神經(jīng)元的膜電位去極化2.6±0.7 mV(n=13,P<0.05)。⑷蛙皮素使NPY神經(jīng)元的輸入電阻減少22.4±5.7％(n=8,P<0.05)。內(nèi)向電流顯示其反轉(zhuǎn)電位在-18.3±3.4 mV。⑸電極內(nèi)液中加入BAPTA(10 mM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神經(jīng)元膜電位去極化作用減少到2.0 mV±0.6 mV(n=5,P<0.05)。使用無(wú)鈣細(xì)胞外液時(shí),

8、蛙皮素(250 nM)引起的NPY神經(jīng)元膜電位去極化作用增加到9.0±1.4 m3/(n=5,P<0.05)。在細(xì)胞外液中加入瞬時(shí)感受器電位(transient receptorpotential,TRP)通道阻斷劑SKF96365(30μM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神經(jīng)元膜電位去極化作用減少到2.7 mV±0.6 mV(n=5,P<0.05)。在細(xì)胞外液加入NiCl2(3 mM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神經(jīng)

9、元膜電位去極化作用減少到2.4±0.7 mV(n=5,P<0.05)。在細(xì)胞外液加入鈉.鈣交換泵阻斷劑KB-R7943(60μM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神經(jīng)元膜電位去極化作用減少到2.3±0.9mV(n=6,P<0.05)。⑹水迷宮實(shí)驗(yàn)中,缺血組大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間(ischemia:24.7±3.8％；sham:37.8±6.1％:ischemia+bombesin:35.5±3.6％)顯著縮短。而假手術(shù)組(P<0

10、.05,ischemiavs sham)和蛙皮素組(P<0.05,ischemia vs ischemia+bombesin)停留時(shí)間較長(zhǎng)。⑺在體LTP實(shí)驗(yàn)中,缺血組大鼠標(biāo)準(zhǔn)化的群峰電位的斜率明顯減少(ischemia:114.0±3.1％；sham:129.8±4.5％,P<0.05),而在蛙皮素組,標(biāo)準(zhǔn)化的群峰電位的斜率與假手術(shù)組無(wú)顯著差異(ischemia+bombesin:125.8±4.3％,P>0.05 vs sham；P<

11、0.05 vs ischemia)。⑻電壓鉗實(shí)驗(yàn)中,給予蛙皮素(250HM)后,鈉電流幅值變?yōu)樵瓉?lái)的83.32±5.98％(n=6,P<0.05),而洗脫后電流幅值恢復(fù)到原來(lái)的97.55±2.19％(n=6,P>0.05)。
　　 結(jié)論：①蛙皮素能夠可逆的興奮NPY神經(jīng)元和POMC神經(jīng)元,并且具有濃度依賴性。②蛙皮素興奮NPY神經(jīng)元的機(jī)制可能來(lái)自激活非選擇性陽(yáng)離子通道和鈉-鈣交換泵。③蛙皮素能夠改善雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎腦缺血大鼠模型