鼻咽癌發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因篩選及Annexin A6基因在鼻咽癌中的表達研究.pdf

1、目的:首先以永生化的鼻咽上皮細胞株(NP69)和鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)細胞株(6-10B、5-8F)為研究模型，從蛋白表達譜入手，采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選NPC中發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因。而后從發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因中選取Annexin A6（ANXA6）為研究對象，檢測ANXA6基因在5-8F、6-10B和NP69細胞株中的甲基化情況，初步闡明ANXA6在NPC中表達下調(diào)的部分機制以及在NPC中的作用。

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　　方法:培養(yǎng)永生化的鼻咽上皮細胞NP69和NPC細胞6-10B、5-8F，分別抽提蛋白質(zhì)，測量蛋白濃度，采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量（Isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/MS)的方法分離鑒定三株細胞的差異表達蛋白，實驗重復(fù)兩次。通過ProteinPilotTM4.2軟件進行Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫

3、搜索及鑒定，從中篩選出6-10B和5-8F兩株NPC細胞相對NP69表達都下調(diào)的差異蛋白，并進行生物信息學(xué)分析。進一步挑選ANXA6基因采用qRT-PCR(Quantitative Reversetranscriptase Polymerase chain reaction)檢測5-8F、6-10B和NP69中mRNA的表達水平;采用蛋白印跡法(Western Blotting)驗證ANXA6蛋白在5-8F、6-10B和NP69三株細胞

4、中的表達水平;采用免疫組織化學(xué)檢測ANXA6蛋白在NPC組織和鼻咽上皮組織中的表達情況，同時統(tǒng)計分析NPC中ANXA6蛋白表達水平與臨床病理特征的關(guān)系;采用亞硫酸氫鹽測序法檢測ANXA6基因在5-8F、6-10B和NP69細胞株中的甲基化情況。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:根據(jù)篩選條件，篩選出兩株NPC細胞相對NP69低表達的差異蛋白98個，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白通過多種信號通路在鼻咽癌發(fā)生過程中發(fā)

5、揮作用。挑選ANXA6進一步研究，qPCR和Western blotting結(jié)果顯示mRNA和蛋白表達情況與iTRAQ的結(jié)果一致:NP69表達高于6-10B，6-10B表達高于5-8F，兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)意義;免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)ANXA6在NPC組織中表達低于鼻咽上皮組織(P＜0.001)，且ANXA6蛋白表達水平與NPC的淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān);亞硫酸氫鹽修飾后基因測序發(fā)現(xiàn)NP69細胞ANXA6基因無甲基化，而6-10B和

6、5-8F存在不同程度的甲基化，其甲基化百分比分別為25.6％、17.9％，NP69與6-10B和5-8F比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而6-10B與5-8F比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:1、本研究以NPC細胞株5-8F、6-10B和永生化的鼻咽上皮細胞株NP69為研究模型，采用iTARQ結(jié)合2DLC-MS/MS的方法篩選出NPC發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因98個。
　　2、ANXA6蛋白在細胞NP69、6-10B、5-8F中表達依次下降，且

7、鼻咽上皮組織、未轉(zhuǎn)移NPC組織、轉(zhuǎn)移NPC組織表達依次下降。據(jù)此推測，ANXA6蛋白表達下調(diào)可能與NPC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　3、ANXA6表達下調(diào)/缺失與NPC遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)，ANXA6表達下調(diào)/缺失的NPC更易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期更晚。
　　4、在NPC中ANXA6基因甲基化是導(dǎo)致其表達下調(diào)/缺失的重要原因之一，同時在轉(zhuǎn)錄水平還有其他的機制參與調(diào)控ANXA6的表達。
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