胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)及不同分化階段細(xì)胞的免疫原性研究.pdf

1、[目的]
　　 通過(guò)研究胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的不同階段細(xì)胞的MHC分子表達(dá)及激活免疫反應(yīng)的情況,明確胚胎干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞分化過(guò)程中的免疫原性變化規(guī)律和激活免疫反應(yīng)的情況,為糖尿病細(xì)胞移植治療的抗移植排斥策略的制定提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1.MEF的制備:取e13.5d的孕小鼠的胚胎,用75％酒精消毒后充分剪碎(1-3mm3),再用0.25%胰酶(Trypsin)-0.02%EDTA

2、溶液消化成細(xì)胞懸液,離心收集細(xì)胞,制備成小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF),經(jīng)傳代2代后純化備用。
　　 2.ESC的擴(kuò)增:小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)接種于經(jīng)絲裂霉素處理的飼養(yǎng)層MEF上,在含15%胎牛血清、1000IU/ml白血病抑制因子(LIF)、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇的DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng),每天換液一次,每3-4天按1:3-4比例傳代擴(kuò)增一次。
　　 3.ESC向IPC分化誘導(dǎo):
　　 3.1擬胚體(e

3、mbryonic bodies,EB)的形成:將培養(yǎng)3-4天的ESC用0.25%胰酶(Trypsin)-0.02%EDTA消化為單細(xì)胞后,接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿,在不含LIF的DMEM高糖培養(yǎng)液中(含15%胎牛血清和O.1mM/Lβ-巰基乙醇),懸浮培養(yǎng)4-5天,使ESC自發(fā)分化為EB。
　　 3.2 nestin陽(yáng)性細(xì)胞(nestin positive cells,NPC)的形成:收集培養(yǎng)4-5天的EB,轉(zhuǎn)種于Ⅰ型膠原蛋白包被過(guò)的培

4、養(yǎng)板,在含15%胎牛血清、不含LIF的DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí),待EB貼壁后更換為無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,添加N2、纖維連接蛋白、bFGF。隔天更換新鮮培養(yǎng)液一次。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3天可形成NPC。
　　 3.3胰島素分泌細(xì)胞(insulin-producing cells,IPC)的形成:NPC形成后,更換為含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、活化素-A、β-細(xì)胞素、煙酰胺、bFGF和不含血清的DMEM/F12的IPC誘導(dǎo)培養(yǎng)液

5、,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng),隔天更換新鮮培養(yǎng)液一次,至第4d,培養(yǎng)液中添加lOmmol/L濃度的葡萄糖,24h后更換為含葡萄糖20mmol/L的新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至IPC形成聚集為胰島樣細(xì)胞團(tuán)(islet-like cell clusters,ICCs)。
　　 4.各階段細(xì)胞的鑒定:
　　 4.1 ESC經(jīng)集落的特殊形念和堿性磷酸酶染色鑒定。
　　 4.2 EB經(jīng)特定培養(yǎng)條件下形成的細(xì)胞團(tuán)形態(tài)而鑒定。
　　 4

6、.3 NPC經(jīng)其形態(tài)及nestin免疫組化染色鑒定。
　　 4.4 IPC經(jīng)其形態(tài)及雙硫腙(DTZ)染色鑒定。
　　 5.ESC向IPC分化各階段細(xì)胞的免疫原性檢測(cè):
　　 5.1 MHC表達(dá)的檢測(cè):ESC、EB、NPC和IPC,用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗體處理后流式細(xì)胞儀(FCM)分析,檢測(cè)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子自發(fā)性表達(dá)情況。為了了解IPC是否會(huì)受到某些增強(qiáng)免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子的刺激而出現(xiàn)MHC分子的誘導(dǎo)性

7、表達(dá),進(jìn)行了IPC的γ-干擾素(IFN-γ)誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn),在IPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入IFN-γ后再分別培養(yǎng)1、3、5天,用FCM檢測(cè)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表達(dá)情況。
　　 5.2混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte culture,MLC):將人外周血淋巴細(xì)胞(human peripheral blood lymphocyte,hPBL)作為反應(yīng)細(xì)胞,ESC和各分化階段細(xì)胞作為刺激細(xì)胞,按1×106反應(yīng)細(xì)胞:1×

8、105刺激細(xì)胞的比例將兩種細(xì)胞混合,在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中行單向MILC,培養(yǎng)4天后用EIASA法測(cè)定培養(yǎng)上清液中的IL-2的濃度,用MTS法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖情況,了解淋巴細(xì)胞活化情況。
　　 [結(jié)果]
　　 1.用e13.5d的孕小鼠胚胎制備出的原代MEF在懸浮狀態(tài)下呈圓形。培養(yǎng)24h后,貼壁細(xì)胞大部分呈長(zhǎng)梭形纖維細(xì)胞樣,細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,一般培養(yǎng)3d左右細(xì)胞生長(zhǎng)匯合。原代的MEF中除有成纖維細(xì)胞

9、外,還混雜有少量圓形細(xì)胞,細(xì)胞密集。傳代純化后的MEF形態(tài)為長(zhǎng)梭形纖維細(xì)胞樣,細(xì)胞純凈,不含其它雜細(xì)胞。
　　 2.ESC接種于飼養(yǎng)層MEF上24h后,ESC細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。每天更換新鮮培養(yǎng)液,ESC細(xì)胞生長(zhǎng)迅速。3-4天形成致密圓形或橢圓形的ESC集落。
　　 3.ESC向IPC分化誘導(dǎo):
　　 3.1懸浮培養(yǎng)4.5天,ESC自發(fā)分化形成團(tuán)狀EB。
　　 3.2 EB誘導(dǎo)培養(yǎng)3-4天,形成了形念為上皮樣細(xì)

10、胞的nestin陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 3.3 nestin陽(yáng)性細(xì)胞形成后,再誘導(dǎo)培養(yǎng)6天以后形成了聚集為胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ICCs)的IPC。
　　 4.各階段細(xì)胞的鑒定:
　　 4.1 ESC集落內(nèi)細(xì)胞呈細(xì)小圓形,核大,細(xì)胞質(zhì)少,細(xì)胞緊密聚集成團(tuán)狀隆起,細(xì)胞間界限不清,但集落周邊與飼養(yǎng)層細(xì)胞有明顯界限,呈致密圓形或橢圓形。ESC集落堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性,ESC集落被染成為棕褐色。
　　 4.2 EB呈圓形細(xì)胞逐

11、漸增多并積聚成團(tuán),其表面有結(jié)節(jié)狀突起。
　　 4.3 NPC形態(tài)為大而扁平的單層生長(zhǎng)的上皮樣細(xì)胞,nestin免疫組化染色呈陽(yáng)性,被染成棕褐色。
　　 4.4 IPC為圓形細(xì)胞并聚集為胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ICCs)。ICCs的DTZ染色呈陽(yáng)性,被染成棕紅色。
　　 5.各分化階段細(xì)胞的免疫原性檢測(cè):
　　 5.1 FCM分別檢測(cè)ESC、EB、NPC和IPC的MHC分子自發(fā)性表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ESC的MHC-Ⅰ分

12、子表達(dá)為(2.13±0.1)%,EB的MH-Ⅰ分子表達(dá)為(3.01±0.3)%,NPC的MHC-Ⅰ分子表達(dá)為(5.15+0.5)%,IPC的MHC-Ⅰ分子表達(dá)為(8.52±0.4)%,它們均無(wú)MHC-Ⅱ分子表達(dá)。IPC的MHC分子的誘導(dǎo)性表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不加IFN-γ、加入IFN-γ后誘導(dǎo)培養(yǎng)1天、加入IFN-γ后誘導(dǎo)培養(yǎng)3天和加入IFN-γ后誘導(dǎo)培養(yǎng)5天的IPC的MHC-Ⅰ分子表達(dá)分別為(8.24±0.3)%、(10.08±0.2)

13、%、(11.50±0.4)%和(13.00±0.5)%,各組均無(wú)MHC-Ⅱ分子表達(dá)。
　　 5.2單向MLC培養(yǎng)4天后,經(jīng)E13SA法測(cè)定培養(yǎng)上清液中的IL-2的濃度,結(jié)果顯示經(jīng)PHA刺激的hPBL的IL-2水平明顯增高,IL-2的濃度為.524.9±7.8 pg/ml;而經(jīng)ESC刺激的淋巴細(xì)胞的IL-2水平無(wú)顯著變化,IL-2的濃度為55.3±5.7pg/ml:但經(jīng)EB、NPC、IPC刺激的淋巴細(xì)胞IL-2的水平也出現(xiàn)增高,I

14、L-2的濃度分別為68.2±4.3 pg/ml、69.5±5.6pg/ml、70.5±4.1pg/ml。經(jīng)MTS法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖活性,結(jié)果顯示hPBL被PHA有效刺激,其OD值為1.078±0.089,然而ESC、EB不能引起hPBL的明顯增殖反應(yīng),其OD值分別為0.629±0.069和0.634±0.063,但NPC、IPC能引起hPBL較低的增殖反應(yīng),其OD值分別為0.654±0.078和0.692±0.076。
　　

15、[結(jié)論]
　　 1.本實(shí)驗(yàn)?zāi)塬@得增殖能力旺盛及純化的MEF飼養(yǎng)層。采用MEF和LIF相結(jié)合的方法培養(yǎng)ESC,ESC擴(kuò)增能力強(qiáng)。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)采用分階段誘導(dǎo)方法,ESC經(jīng)過(guò)連續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo),可以在18天的時(shí)間內(nèi)獲得具有胰島β-細(xì)胞特征的IPC。
　　 3.ESC低表達(dá)MHC-Ⅰ分子,無(wú)MHC-Ⅱ分子表達(dá),免疫原性低,體外培養(yǎng)條件下不能激活免疫反應(yīng)。
　　 4.EB的MHC-Ⅰ分子表達(dá)有所增加,不表達(dá)MHC-