生物質(zhì)譜離子化源輔助配件研制及蛋白質(zhì)組絕對(duì)定量新方法研究.pdf

1、隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法研究的深入，蛋白組學(xué)研究已由原來的兩譜三圖三庫進(jìn)一步向蛋白質(zhì)組深度覆蓋和定量研究發(fā)展。蛋白質(zhì)組深度覆蓋是蛋白質(zhì)組注釋基因組、發(fā)現(xiàn)診斷標(biāo)志物、藥物靶標(biāo)和關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子的前提和基礎(chǔ)，而蛋白質(zhì)組定量信息的獲得有利于蛋白質(zhì)功能的發(fā)現(xiàn)和深度解析。蛋白質(zhì)組深度覆蓋的含義包括蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)鑒定的深度覆蓋和蛋白質(zhì)序列的長度覆蓋。隨著液相色譜及質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組深度覆蓋和蛋白質(zhì)組定量的

2、常用手段。然而由于在蛋白質(zhì)組分析過程中，存在蛋白質(zhì)樣品制備時(shí)產(chǎn)生的損耗、樣本的不完全酶解、質(zhì)譜靈敏度低等問題，影響了低豐度蛋白的鑒定，因而限制了蛋白質(zhì)組覆蓋度的提高和更多蛋白定量信息的獲取。另外，采用化學(xué)合成方法制備內(nèi)標(biāo)肽段，價(jià)格昂貴、產(chǎn)量低，而體外標(biāo)記SILAC方法和體內(nèi)標(biāo)記iTRAQ或TMT價(jià)格昂貴，限制了定量蛋白質(zhì)組技術(shù)的廣泛應(yīng)用。
　　針對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中存在的問題，本論文首先在質(zhì)譜靈敏度方面，研制了一種新型離子源輔助部件

3、，以提高質(zhì)譜靈敏度與穩(wěn)健性;其次，針對(duì)實(shí)際樣本酶解不完全問題，研究了通過提高蛋白水解酶的量以增加酶切速度和效率的可行性;最后，針對(duì)蛋白質(zhì)組絕對(duì)定量方法中存在的問題，首先基于金屬標(biāo)簽的價(jià)格低廉的特點(diǎn)，和選擇離子監(jiān)測(cè)質(zhì)譜高靈敏度的特點(diǎn)，發(fā)展了一種絕對(duì)定量新方法。其次發(fā)展了反相色譜填料（C18填料）輔助的18O標(biāo)記定量肽段串聯(lián)體蛋白（quantification concatamer，QconCAT）結(jié)合液-質(zhì)聯(lián)用的蛋白質(zhì)組絕對(duì)定量新方法。<

4、br>　　本論文由四章組成。第一章概述了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究現(xiàn)狀、質(zhì)譜離子源研究現(xiàn)狀以及蛋白質(zhì)酶解效率對(duì)蛋白質(zhì)組研究的影響、金屬標(biāo)記及18O標(biāo)記結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜定量方法的最新進(jìn)展，并在目前研究背景下提出了本課題的研究內(nèi)容。
　　在第二章，研制了一種離子源輔助部件，不僅提高了目前使用電噴霧離子源的流速，并且增加了靈敏度和噴霧的穩(wěn)定性。輔助部件設(shè)計(jì)時(shí)，首先通過電動(dòng)力學(xué)方法模擬對(duì)影響離子源靈敏度的兩個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，然后通過制作輔助部件

5、提高了離子化效率及傳輸效率，進(jìn)而提高了質(zhì)譜的靈敏度。首先用多場(chǎng)耦合分析計(jì)算軟件對(duì)離子源輔助部件形狀進(jìn)行設(shè)計(jì)，之后用標(biāo)準(zhǔn)肽段樣品對(duì)輔助部件性能進(jìn)行檢驗(yàn)。裝有輔助部件的離子源流速設(shè)為1-2μL/min后，信號(hào)比未使用輔助部件離子源提高了5.6倍，即信噪比增加為原來的2.8倍;定量限比未使用輔助部件納升源降低65％，且流速保持在在1-2μL/min，增加了質(zhì)譜分析的穩(wěn)定性。
　　在第三章，我們將金屬標(biāo)簽與選擇離子監(jiān)測(cè)技術(shù)集合起來，建立了

6、一種蛋白質(zhì)絕對(duì)定量新方法。首先考察了多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)質(zhì)譜技術(shù)和選擇離子監(jiān)測(cè)質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度，表明在分析組成簡單的樣品時(shí)選擇離子檢測(cè)質(zhì)譜技術(shù)有更好的靈敏度;其次考察了金屬標(biāo)簽用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)的可行性，對(duì)標(biāo)記效率、標(biāo)記歧視性、標(biāo)記穩(wěn)定性和金屬標(biāo)記肽段色譜保留行為進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金屬標(biāo)記可以用于絕對(duì)定量。采用建立的蛋白質(zhì)絕對(duì)定量新方法對(duì)騰沖嗜熱菌蛋白進(jìn)行定量，結(jié)果表明絕對(duì)定量方法的靈敏度高，定量限為1 fmol;線性范圍為1fmol～

7、500 fmol時(shí)，線性范圍內(nèi)R2值大于0.99，具有良好的線性;測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)肽段回收率為117.01％，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度;將該方法應(yīng)用于騰沖嗜熱菌中烯醇酶蛋白的定量分析，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.47％，表明定量結(jié)果可信。結(jié)果表明該定量方法可以用于蛋白質(zhì)組絕對(duì)定量分析，是簡單樣本的一種新的方法選擇
　　在第四章，我們發(fā)展了一種通過增大酶量的蛋白質(zhì)樣本快速、高效酶切方法，并基于這種酶切方法發(fā)展了18O標(biāo)記QconCAT結(jié)合液-質(zhì)聯(lián)

8、用的目標(biāo)蛋白質(zhì)組絕對(duì)定量新方法。在溶液狀態(tài)下，通過增加蛋白酶量至酶與底物質(zhì)量比為1∶1時(shí)，可在37℃下2小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白樣品的完全酶切，且未發(fā)生自切現(xiàn)象。對(duì)酶切后的多肽混合物，通過反相色譜柱分離，實(shí)現(xiàn)蛋白酶及酶切肽段的分離，并回收了蛋白酶。進(jìn)一步通過對(duì)回收后的蛋白酶酶切效率進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的酶切效率沒有降低，可重復(fù)使用。使用該方法的優(yōu)點(diǎn)是與一般酶切方法相同，容易掌握，操作簡單，酶切時(shí)間短、效率高?；谠摲椒ǖ?8O標(biāo)記方法不僅標(biāo)記時(shí)