rhGH對大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡、血管形成及Nestin表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的
　　 缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后,組織器官損傷反而加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷,是臨床上常見的一種病理生理現(xiàn)象,許多缺血性疾病都可以出現(xiàn)缺血再灌注損傷,如:冠心病,腦梗死等的動脈搭橋術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)、溶栓療法等可以使缺血的組織器官重新得到血液再灌注,產(chǎn)生缺血再灌注損傷。在缺血性腦血管疾病中,如何減輕這種再灌注損傷是目前研究的熱點之一

2、。
　　 生長激素(growth hormone,GH)是由垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素,由191個氨基酸殘基組成的非糖基化蛋白。GH不僅參與大腦的生長和發(fā)育,而且還是一種神經(jīng)保護因子。研究表明GH可直接或通過胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)來發(fā)揮其生物活性,可能通過抑制細(xì)胞凋亡、促進血管的生成、減少炎癥反應(yīng)、體外研究GH還具有促進神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化等。目前國內(nèi)外尚缺乏

3、GH在腦缺血再灌注損傷中對細(xì)胞凋亡、新生血管形成及Nestin表達(dá)的研究。本實驗的目的是為GH的臨床應(yīng)用提供初步的理論依據(jù)。
　　 本研究采用TUNEL法計算海馬區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)來探討GH的抑制細(xì)胞凋亡作用,用免疫組織化學(xué)法觀察海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)和缺血周圍CD34所標(biāo)記的陽性新生血管數(shù)目,TTC染色顯示腦缺血區(qū),進一步探討GH腦保護作用。
　　 材料與方法
　　 1實驗動物分組及給藥方法
　　 選用

4、健康雄性SD大鼠90只,體重250～280g(由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供)。隨機分為假手術(shù)組(假手術(shù)+生理鹽水組)、對照組(腦缺血再灌注+生理鹽水組)、治療組(腦缺血再灌注+重組人生長激素組)三組,每組30只,每組又分為7d、14d、21d三個亞組。采用改良的Longa線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。造模成功后,治療組給予皮下注射rhGH,而對照組及假手術(shù)組皮下注射生理鹽水,其注射時間、部位及劑量同治療組。
　　 2組

5、織切片的制備
　　 大鼠斷頭取腦后,在相應(yīng)時間點灌注、取材,常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋,制成4μm切片,然后染色,分別進行凋亡細(xì)胞數(shù)計數(shù)、TTC法顯色、Nestin和CD34免疫組化染色。
　　 3指標(biāo)檢測
　　 (1)TUNEL法計算海馬區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)目。
　　 (2)應(yīng)用免疫組化染色法檢測海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)和缺血周圍CD34標(biāo)記的新生血管數(shù)。
　　 (3)TTC法顯示腦梗死區(qū)

6、域,以Ulead Photo Express2.0圖像分析軟件進行腦梗死輪廓勾畫,法醫(yī)損傷測量軟件測量腦梗死面積,腦梗死面積之和乘以切片厚度即可得到腦梗死的近似體積。
　　 (4)圖像分析
　　 每只大鼠連續(xù)切片,每4張抽取一張切片,選取5個不同海馬及周圍區(qū)域進行高倍鏡(400×)觀察,TUNEL法進行凋亡細(xì)胞計數(shù),應(yīng)用圖象分析系統(tǒng)對免疫染色的陽性細(xì)胞數(shù)進行定量分析,TTC染色,測量腦梗死面積。
　　 4統(tǒng)計學(xué)方

7、法
　　 所有數(shù)據(jù)以(X)±S表示,采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,相同時間點不同組間比較采用方差分析,組間比較采用t檢驗。以α=0.05作為檢驗性水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1 TUNEL法細(xì)胞凋亡計數(shù)變化
　　 假手術(shù)組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)在7d、14d、21d分別為9.34±1.41,6.63±1.08,5.16±0.76,隨時間變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組不同時間點神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目

8、為70.98±1.99,61.85±1.86,46.23±2.13；治療組為59.92±1.92,48.36±2.30,40.76±1.94。在相應(yīng)時間點,治療組均較對照組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2 Nestin表達(dá)的動態(tài)變化
　　 在假手術(shù)組海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)有少量表達(dá),差異無統(tǒng)計學(xué)意義；7d、14d、21d治療組Nestin表達(dá)為:53.18±1.99,39.26±1.

9、75,31.10±1.67；對照組為:35.12±1.94,29.76±1.93,27.66±1.58；治療組在對應(yīng)時間點高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3 CD34標(biāo)記的新生血管的變化
　　 假手術(shù)組缺血周圍僅有少量的新生血管,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組在7d、14d、21d分別為12.72±1.05,8.61±1.01,7.47±1.37,7d時新生血管數(shù)最多,隨時間的延長而減少；

10、不同時間點治療組為15.43±0.69,13.52±1.37,11.65±1.08,但在相應(yīng)的時間點高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,(P<0.05)。
　　 4 TTC法顯示的腦組織形態(tài)學(xué)改變
　　 假手術(shù)組未見梗死灶;對照組和治療組可見白色梗死區(qū)域,與周圍有明顯的界限。治療組不同亞組的梗死體積為:37.62±0.88mm3,74.99±4.38mm3,74.24±1.72mm3；對照組為:81.84±2.27mm3,11