水稻OsMAP65家族t-DNA插入突變體的篩選及表型鑒定.pdf

1、微管(MT)是細(xì)胞骨架的主要組成元件之一，其基本組成單位是微管蛋白(tubulin)。微管具有動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性，且參與細(xì)胞的許多生命活動(dòng)過程。在微管結(jié)合蛋白(MAPs)的協(xié)助下，微管蛋白對(duì)非生物脅迫（高鹽、高滲、病害等）的耐受性發(fā)揮重要的作用，從而應(yīng)對(duì)各種各樣的細(xì)胞內(nèi)部和外部刺激。MAPs的異常表達(dá)或者錯(cuò)誤修飾都有可能會(huì)導(dǎo)致微管產(chǎn)生紊亂的現(xiàn)象，并有可能導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，如癌癥等。MAP65是一類植物所特有的微管結(jié)合蛋白。最近在擬南芥中的研

2、究表明，在鹽脅迫時(shí)敲除MAP65-1會(huì)導(dǎo)致微管解聚，而MAP65-1過表達(dá)則會(huì)增加耐鹽性。這些結(jié)果表明在植物遭受各種非生物脅迫時(shí)MAP65具有調(diào)控微管組織的重要作用。在植物中，對(duì)擬南芥AtMAP65家族的基因的研究已有相關(guān)報(bào)道，而對(duì)單子葉模式植物——水稻(Oryza sativa)的OsMAP65家族的基因的研究還是很缺乏。因此，開展水稻O.sMAP65家族T-DNA插入突變體的篩選對(duì)進(jìn)一步研究水稻耐逆性的分子機(jī)理具有重要的生物學(xué)意義。

3、
　　本實(shí)驗(yàn)主要開展了以下幾項(xiàng)研究工作:(1)通過半定量RT-PCR技術(shù)分析逆境脅迫下水稻OsMAP65家族成員在粳稻品種日本晴中不同部位的表達(dá)情況;(2)對(duì)水稻OsMAP65相關(guān)基因的T-DNA插入突變體進(jìn)行純合突變體篩選及鑒定;(3)對(duì)篩選出的純合突變體的表型及農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查分析;(4)對(duì)OsMAP65-1的純合突變體map65-1的有斑的株系(HM-4)進(jìn)行細(xì)胞死亡鑒定、接菌試驗(yàn)及Tail-PCR分析。具體研究結(jié)果如下:<

4、br>　　(1)在高鹽和干旱脅迫下，水稻OsMAP65家族成員在粳稻品種日本晴中不同部位的表達(dá)情況均不相同。例如，OsMAP65-1在鹽處理和PEG6000處理后的表達(dá)情況不同，鹽處理0h時(shí)在水稻的地上部分不表達(dá)，但是處理后3h發(fā)生誘導(dǎo)表達(dá)，持續(xù)到6h，9h后表達(dá)量則持續(xù)降低;PEG6000處理時(shí)地上部分則不表達(dá)，而地下部分兩種處理時(shí)該基因則一直有表達(dá)，說明這些逆境脅迫處理對(duì)該基因都有影響。
　　(2)利用“雙引物法(LP+RP，

5、RP+RB)”和“三引物法(LP+RP+RB)”篩選鑒定從國(guó)外購(gòu)買的水稻OsMAP65基因相關(guān)的11種T-DNA插入突變體。鑒定結(jié)果:有3個(gè)純合體突變體的株系，分別是map65-1，map65-3，map65-7;有4個(gè)雜合的突變體的株系，分別是map65-2,map65-6,map65-8,map65-10。
　　(3)T-DNA插入純合突變體map65-1和map65-3在苗期時(shí)和野生型粳稻Dongin相比，長(zhǎng)勢(shì)較慢，植株矮小

6、;栽種大田后發(fā)現(xiàn)抽穗期的突變體和野生型相比，分蘗數(shù)多且株型緊湊;成熟期時(shí)突變體雖然有效穗數(shù)比野生型多，但是飽實(shí)率非常低，幾乎全是癟粒。此外，還發(fā)現(xiàn)OsMAP65-1的純合突變體map65-1有些株系從五葉期時(shí)植株葉片上就出現(xiàn)了紅褐色斑點(diǎn)，疑似類病斑，并一直持續(xù)到成熟期。
　　農(nóng)藝性狀鑒定結(jié)果表明:T-DNA插入純合突變體與野生型相比較，在分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、主莖穗長(zhǎng)這些農(nóng)藝性狀上有極顯著提高;在二次枝梗數(shù)這個(gè)農(nóng)藝性狀方面有顯著下降;

7、而在株高、穗抽出度、穗粒數(shù)、劍葉長(zhǎng)度、千粒重這幾個(gè)農(nóng)藝性狀方面有極顯著下降。在粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚和劍葉寬度方面沒有顯著差異。在莖節(jié)方面，T-DNA插入純合突變體與野生型相比較，除了第一莖節(jié)是顯著下降，其他全是極顯著下降。
　　(4)取OsMAP5-1的純合突變體map65-1有斑植株的葉片，進(jìn)行NBT、DAB染色，證明該葉片的細(xì)胞發(fā)生死亡。同時(shí)，對(duì)該有斑植株進(jìn)行接菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該有斑植株對(duì)白葉枯病菌生理小種P2(PXO86)有一定的抗