牙齦卟啉單胞菌脂多糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能影響的實驗研究.pdf

1、目的：觀察三種不fimA基因型P.gingivalis-LPS對HUVEC產(chǎn)生致炎細(xì)胞因子、趨化因子以及黏附分子的影響，初步探討P.gingivalis感染在AS發(fā)生和發(fā)展的可能作用以及作為牙周炎與AS相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)的可能。
　　 方法：厭氧培養(yǎng)Ⅰ fimA型（ATCC33277）、ⅡfimA型（WCSP115）、ⅢfimA型（W83）P.gingivalis，采用熱酚-水法提取P.gingivalis-LPS，應(yīng)用SDS-PA

2、GE+銀染、紅外線光譜分析、鱟試驗對提取的脂多糖予以鑒定；體外培養(yǎng)HUVEC，待HUVEC單層融合后，分別加入不同終濃度的P.gingivalis-LPS，共同培養(yǎng)2h、6h、24h，應(yīng)用ELISA法測定培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和MCP-1的分泌量；提取HUVEC總RNA，RT-PCR法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)水平，F(xiàn)CM技術(shù)檢測H

3、UVEC表面ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)量。
　　 結(jié)果：（1）本實驗研究條件下所提取的P.gingivalis細(xì)菌物質(zhì)經(jīng)紅外光譜分析和SDS-PAGE電泳分析，表明其結(jié)構(gòu)與Ecoli-LPS相似，系P.gingivalis-LPS，鱟試驗表明所提取的P.gingivalis-LPS具有較高的生物學(xué)活性（≥15ng/ml），可用于后續(xù)的實驗。
　　 （2）3型P.gingivalis-LPS作用于HUVEC后，細(xì)胞

4、表達(dá)IL-1β蛋白水平及mRNA水平升高，在較高濃度（5、10μg/ml）時，Ⅱ型fimA P.gingivalis-LPS刺激HUVEC IL-1β蛋白水平及mRNA的表達(dá)強(qiáng)于Ⅰ型fimA P.gingivalis-LPS。
　　 在3型P.gingivalis-LPS刺激下，HUVEC IL-6水平的升高發(fā)生在轉(zhuǎn)錄mRNA水平和轉(zhuǎn)錄后蛋白水平，且存在著濃度依賴效應(yīng)；不同fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激作用存

5、在著差異。在蛋白水平上，Ⅱ型和Ⅳ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激作用強(qiáng)于Ⅰ型fimA基因型P.gingivalis-LPS，但上調(diào)作用出現(xiàn)較晚。在mRNA水平上，Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC表達(dá)IL-6 mRNA的作用較強(qiáng)。
　　 在3型Pgingivalis-LPS刺激下，HUVEC TNF-α蛋白水平及mRNA的表達(dá)量上調(diào)，且存在著濃度依賴效應(yīng)，蛋白水平在24h時表達(dá)量

6、達(dá)到高峰。在一些濃度下，Ⅱ型fimAP.gingivalis-LPS刺激HUVECTNF-α蛋白水平比Ⅳ型fima P.gingivalis-LPS的作用強(qiáng)。在mRNA水平上，高濃度（5、10μg/ml）時，Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS具有較強(qiáng)的刺激HUVEC表達(dá)TNF-αmRNA的作用。
　　 提示3型P.gingivalis-LPS對HUVEC表達(dá)IL-1β、IL-6和TNF-α，的調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄

7、后兩個水平，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，可能在AS的進(jìn)程中起到關(guān)鍵的作用，且fima基因型的差異可能導(dǎo)致P.gingivalis-LPS在調(diào)控HUVEC產(chǎn)生致炎細(xì)胞因子的能力存在差異。
　　 （3）本實驗研究條件下，應(yīng)用3型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC后細(xì)胞表達(dá)IL-8蛋白水平和mRNA的水平升高，且存在著濃度依賴效應(yīng)。mRNA水平6h時達(dá)到高峰，蛋白水平24h時分泌量達(dá)到高峰。3型P.gingivalis-

8、LPS間刺激HUVEC表達(dá)IL-8蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。6h時，51μg/ml濃度Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS較強(qiáng)刺激HUVEC表達(dá)IL-8mRNA的作用（p<0.05）。
　　 在3型P.gingivalis-LPS刺激下，HUVECMCP-1的升高發(fā)生在轉(zhuǎn)錄mRNA水平和轉(zhuǎn)錄后蛋白水平，且存在著濃度依賴效應(yīng)，mRNA水平在6h時達(dá)到高峰，24h時恢復(fù)到正常水平；蛋白水平在24h時達(dá)到

9、高峰。Ⅰ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC MCP-1的蛋白表達(dá)強(qiáng)于Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS。
　　 提示P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVEC產(chǎn)生趨化因子的作用可能在AS進(jìn)程中發(fā)揮作用。fimA基因型的差異可能導(dǎo)致P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVEC表達(dá)MCP-1的能力存在著差異。
　　 （4）本實驗研究條件下，P.gingivalis-LPS刺激

10、HUVEC后表達(dá)VCAM-1 mRNA與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）；在6h時，較高濃度的（5、10μg/ml）Ⅰ型和Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC表達(dá)ICAM-1 mRNA表達(dá)增加，Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS這種上調(diào)作用強(qiáng)于Ⅰ型和Ⅳ型fimA P.gingivalis-LPS；但在蛋白水平上，本實驗條件下未能檢測到VCAM-1和ICAM-1蛋白水平的升高。<

11、br>　　 提示較高濃度下，P.gingivalis-LPS可刺激HUVEC表達(dá)ICAM-1 mRNA的水平上調(diào)，P.gingivalis-LPS對HUVEC產(chǎn)生VCAM-1mRNA的作用不明顯。
　　 結(jié)論：3型P.gingivalis-LPS均能刺激HUVEC表達(dá)致炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α，趨化因子IL-8和MCP-1，而且使黏附分子ICAM-1mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高。不同fimA基因型P.gingival