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1、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(Insulin-likeGrowthFactor-IReceptor,IGF-1R)是受體型酪氨酸激酶(ReceptorTyrosineKinase,RTK)家族中的成員之一,在很多腫瘤細(xì)胞中,都存在IGF-1R的過度表達(dá)。IGF-1R是由位于胞外的α亞基和位于胞內(nèi)的β亞基構(gòu)成,兩亞基以二硫鍵連接。其中α亞基負(fù)責(zé)與胞外配體結(jié)合,β亞基含有激酶催化結(jié)構(gòu)域和多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。當(dāng)配體結(jié)合或因過度表達(dá)而導(dǎo)致受體活化時(shí),β亞基
2、胞內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化,從而募集下游含有PTB結(jié)構(gòu)域的胰島素受體底物1/2(InsulinReceptorSubstrate1/2,IRS-1/2)等接頭分子,進(jìn)而激活下游MAPK和PI-3K等信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲,抑制細(xì)胞凋亡,加速腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。胰島素受體(InsulinReceptor,InsR)作為細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的“幫兇”,與IGF-1R具有同樣的胞內(nèi)接頭分子,介導(dǎo)相同的細(xì)胞信號(hào)通路,引起類似的細(xì)胞效應(yīng)。因此
3、,IGF-IR和InsR是抗腫瘤治療的理想靶位。
泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程,是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)負(fù)向調(diào)節(jié)的主要方式。泛素化反應(yīng)過程是在泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)的協(xié)同作用下,使被降解的蛋白發(fā)生泛素化,進(jìn)而在蛋白酶體或溶酶體中降解。其中E3是蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵連接蛋白,它能夠特異性識(shí)別與結(jié)合底物,并將泛素轉(zhuǎn)移至底物。本研究中利用具有泛素連接酶活性的CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域和Cbl的RING結(jié)構(gòu)域行使降
4、解功能,下調(diào)靶蛋白IGF-IR和InsR的水平,達(dá)到抑制腫瘤的目的。
在本研究的第一部分實(shí)驗(yàn)中,我們通過重組PCR,將IRS-1蛋白中能夠與磷酸化的IGF-IR和InsR結(jié)合的PTB結(jié)構(gòu)域(PhosphotyrosineBindingdomain)的基因與CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域基因或者Cbl的RING結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)行基因融合,將融合基因插入真核表達(dá)載體pFLAG-CMV4,構(gòu)建重組泛素連接酶。在第二部分實(shí)驗(yàn)中,我們檢測(cè)了重組
5、泛素連接酶在幾種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)和對(duì)靶蛋白的降解作用。研究的第三部分,著重考察了重組泛素連接酶對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。
實(shí)驗(yàn)一:設(shè)計(jì)引物,利用普通PCR分別擴(kuò)增IRS-1的PTB結(jié)構(gòu)域基因、CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域基因和Cbl的RING結(jié)構(gòu)域基因,PTB的下游引物與U-box、RING的上游引物設(shè)計(jì)了幾個(gè)連續(xù)的反向互補(bǔ)序列,利用重組PCR可將PTB與U-box、PTB與RING進(jìn)行基因融合,獲得的產(chǎn)物分別命名
6、為PTB-U-box和PTB-RING。將融合基因產(chǎn)物進(jìn)行EcoRI、EcoRV雙酶切處理,插入真核表達(dá)載體pFLAG-CMV4。經(jīng)過酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證后,將重組質(zhì)粒命名為pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING,以及功能結(jié)構(gòu)域缺失的pFLAG-CMV4-PTB。
實(shí)驗(yàn)二:將構(gòu)建成功的重組泛素連接酶轉(zhuǎn)染幾種IGF-IR和InsR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系,包括SK-Br-3、HepG2、HHCC
7、以及HeLa,設(shè)立pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING為實(shí)驗(yàn)組,功能結(jié)構(gòu)域缺失的pFLAG-CMV4-PTB和空載體pFLAG-CMV4為陰性對(duì)照,檢測(cè)重組泛素連接酶在其中的表達(dá),以及對(duì)靶蛋白水平的下調(diào)情況,結(jié)果顯示兩種重組泛素連接酶均能促使靶蛋白發(fā)生不同程度的下調(diào)。同時(shí)設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行Real-timePCR實(shí)驗(yàn),檢測(cè)重組泛素連接酶的導(dǎo)入,對(duì)靶蛋白的mRNA水平是否造成影響,以確定靶蛋白豐度的
8、降低是在翻譯后水平產(chǎn)生的。
實(shí)驗(yàn)三:隨后選取了降解效果最明顯的HeLa細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),設(shè)立pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING為實(shí)驗(yàn)組,pFLAG-CMV4-PTB、和pFLAG-CMV4為陰性對(duì)照,MTT比色實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組泛素連接酶對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖能力的影響,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響。結(jié)果顯示,兩種重組泛素連接酶能夠明顯的抑制腫瘤細(xì)胞
9、的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲能力。
綜上所述,在多種腫瘤細(xì)胞中都存在RTK的異?;罨瓦^度表達(dá),靶向降解這些分子是行之有效的抑制腫瘤的方法。IGF-1R和InsR都是RTK家族中的重要成員,參與腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。它們的下調(diào)能夠抑制腫瘤的發(fā)展,所以成為腫瘤治療中的理想靶位。泛素化是一種常見的翻譯后修飾方式,經(jīng)典的泛素化修飾介導(dǎo)蛋白質(zhì)的泛素-蛋白酶體降解途徑,使被修飾的底物蛋白發(fā)生降解。利用能夠特異結(jié)合IGF-1R和InsR的接頭分子的受體
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