二氧化碳超臨界萃取元胡白芷配方的鎮(zhèn)痛作用研究.pdf

1、目的：
　　 元胡止痛片是臨床常用的鎮(zhèn)痛效果確切的中成藥，其組方簡(jiǎn)單、療效確切，收載于1985年以后各版中國(guó)藥典。其制法常采用傳統(tǒng)醇回流提取法，導(dǎo)致藥物服用量大、起效慢等不足，限制了該藥物的臨床應(yīng)用，因此進(jìn)行其制備新工藝的研究是必要的。本課題在先期研究基礎(chǔ)上，使用二氧化碳超臨界萃取法(CO2-SFE)對(duì)元胡白芷藥材進(jìn)行提取，采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)CO2-SFE和傳統(tǒng)醇回流提取法所得萃取物進(jìn)行比較，客觀評(píng)價(jià)兩種提取方法的

2、優(yōu)劣。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的研究是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容，雖元胡、白芷單藥成分的鎮(zhèn)痛機(jī)制已有部分研究，但兩者配伍應(yīng)用對(duì)體內(nèi)致痛和鎮(zhèn)痛物質(zhì)的影響并未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬觀察元胡白芷配方藥液對(duì)不同大鼠疼痛模型的鎮(zhèn)痛作用，并從體內(nèi)因子含量水平，探討其相關(guān)的鎮(zhèn)痛機(jī)制;并進(jìn)一步比較CO2-SFE與傳統(tǒng)醇回流法引起的藥效作用差異。
　　 方法：
　　 1.藥物的提取及含量測(cè)定:(1)CO2-SFE提取元胡白芷藥材:采用已優(yōu)化的C

3、O2-SFE提取工藝，設(shè)定相應(yīng)參數(shù)，對(duì)元胡白芷藥材分別進(jìn)行提取;(2)醇回流法提取元胡白芷:采用藥典及文獻(xiàn)中報(bào)道的方法，對(duì)元胡白芷藥材進(jìn)行提取;(3)HPLC含量測(cè)定:以延胡索乙素(THP)為質(zhì)控指標(biāo)，測(cè)定元胡萃取液的提取率;以歐前胡素及異歐前胡素為指標(biāo)，測(cè)定白芷萃取液的提取率。
　　 2.元胡白芷對(duì)β-內(nèi)啡肽及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響研究:(1)建立大鼠福爾馬林疼痛模型;(2)記錄觀察大鼠行為學(xué)指標(biāo)變化，評(píng)價(jià)藥物的鎮(zhèn)痛效果;(3)

4、采用放射性免疫標(biāo)記法測(cè)定大鼠血漿及腦組織中β-內(nèi)啡肽含量;(4)采用HPLC-熒光檢測(cè)法測(cè)定大鼠血中及腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(5-HT，DA，NE)含量。
　　 3.元胡白芷對(duì)前列腺素類物質(zhì)的影響研究:(1)建立大鼠痛經(jīng)模型;(2)記錄觀察大鼠扭體反應(yīng)的發(fā)生率及發(fā)生次數(shù)，評(píng)價(jià)藥物的鎮(zhèn)痛效果;(3)采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定大鼠血漿中前列腺素E2及F2α的含量，并計(jì)算兩者的比值。
　　 4.藥效作用的比較研究:使用2和3中提到的動(dòng)

5、物模型及實(shí)驗(yàn)步驟，動(dòng)物分組設(shè)置CO2-SFE、醇回流提取組，比較兩種提取方法在鎮(zhèn)痛作用方面的差異。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料應(yīng)用(X)±s表示，兩組間比較采用非配對(duì)t-檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.CO2-SFE提取物含量?jī)?yōu)于醇回流法:經(jīng)CO2-SFE提取元胡生藥材，以THP計(jì)，含量為0.800mg/g

6、生藥材，醇回流法提取的含量為0.255mg/g生藥材;白芷經(jīng)CO2-SFE提取，以IMP計(jì)，含量為0.635mg/g藥材，iso-IMP含量為0.340mg/g藥材，醇回流法所得萃取液的含量分別為0.309mg/g藥材及0.286mg/g藥材。CO2-SFE所得藥物有效成分含量明顯高于醇回流法。
　　 2.元胡白芷配方能夠降低β-EP及外周血中5-HT、DA及NE的含量:(1)成功復(fù)制大鼠福爾馬林疼痛模型，大鼠表現(xiàn)典型的雙時(shí)相痛

7、反應(yīng)行為;(2)元胡白芷配方對(duì)福爾馬林疼痛模型有很好的鎮(zhèn)痛效果，且以對(duì)第Ⅱ時(shí)相作用為主;(3)與模型組相比，元胡白芷配方能夠降低腦組織中β-EP含量(P＜0.05)，降低血漿中β-EP含量(P＜0.05)，與嗎啡組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;但不存在劑量依賴關(guān)系;(4)與模型組相比，元胡白芷配方能夠顯著降低外周血中5-HT、DA及NE的含量(P＜0.05)，對(duì)中樞內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響不明顯。
　　 3.元胡白芷配方可降低痛經(jīng)模型血中PG

8、F2α的含量，降低PGF2α/PGE2，具有劑量依賴關(guān)系:(1)成功復(fù)制大鼠痛經(jīng)模型，以扭體反應(yīng)的發(fā)生率及發(fā)生次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià);(2)元胡白芷配方對(duì)大鼠痛經(jīng)效果良好，可顯著降低扭體反應(yīng)的發(fā)生率，且存在劑量依賴性;(3)與模型組相比，元胡白芷配方可降低痛經(jīng)模型大鼠外周血中PGF2α的含量(P＜0.05)，升高PGE2的含量，能夠劑量依賴性地降低PGF2α/PGE2（P＜0.05），高劑量組與阿司匹林組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

9、　　 4.CO2-SFE提取物藥效優(yōu)于醇回流法:(1)大鼠福爾馬林疼痛模型:同等劑量元胡白芷提取液，CO2-SFE組鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于醇回流組，痛反應(yīng)持續(xù)時(shí)間短;與模型組相比，血漿、腦組織β-EP的含量，CO2-SFE組分別降低36％，16％;而醇提取β-EP的含量降低約25％，12％(P＜0.05);(2)大鼠痛經(jīng)模型:同等劑量元胡白芷提取液，CO2-SFE組扭體反應(yīng)的發(fā)生率及發(fā)生時(shí)間均低于醇回流組;與模型組相比，給藥組可降低PGF2α的

10、含量(P＜0.01):CO2-SFE組降低23.7％，醇提取組降低約16.2％。
　　 結(jié)論：
　　 1.建立了HPLC測(cè)定THP、IMP及iso-IMP的方法;經(jīng)HPLC測(cè)定，與醇回流法相比，CO2-SFE所得元胡白芷藥材提取液，有效成分的萃取率顯著高于傳統(tǒng)醇回流法，且操作簡(jiǎn)單。
　　 2.元胡白芷配方對(duì)福爾馬林疼痛模型第Ⅱ時(shí)相鎮(zhèn)痛效果好;能顯著降低腦組織和血漿中β-EP含量，推測(cè)其鎮(zhèn)痛作用的發(fā)揮與內(nèi)源性阿片肽

11、系統(tǒng)有重要的關(guān)系;對(duì)中樞內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量沒有明顯影響。
　　 3.通過雌激素聯(lián)合縮宮素可成功建立大鼠痛經(jīng)模型，具有與人類原發(fā)性痛經(jīng)機(jī)理類似、建模時(shí)間短、適于藥物干預(yù)的特征;元胡白芷配方藥液對(duì)痛經(jīng)模型大鼠有顯著鎮(zhèn)痛效果，能夠劑量依賴性降低PGF2α的含量，降低PGF2α/PGE2，推測(cè)鎮(zhèn)痛作用的發(fā)揮與降低前列腺素的含量密切相關(guān)。
　　 4.兩種方法（CO2-SFE與醇回流）所得提取液用于兩個(gè)疼痛模型均可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果，