蛋白激酶B底物AS160在有氧運(yùn)動(dòng)改善胰島素抵抗過程中的作用.pdf

1、目的：
　　通過高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠以建立胰島素抵抗（IR）動(dòng)物模型，觀察正常飲食小鼠和IR小鼠在安靜/有氧運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞蛋白激酶B（PKB/Akt）及其下游效應(yīng)因子Akt底物蛋白160（AS160）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）基因和蛋白表達(dá)的變化，探討Akt/AS160信號(hào)通路在IR發(fā)生中的作用，以及有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)IR小鼠骨骼肌細(xì)胞Akt/AS160信號(hào)通路和GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，并探究其分子生物學(xué)機(jī)制，以期為揭示有氧

2、運(yùn)動(dòng)防治IR及其相關(guān)代謝性疾病提供理論依據(jù)。
　　方法：
　?。?）IR動(dòng)物模型的建立：4周齡雄性C57BL/6小鼠80只，經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨機(jī)分為正常飲食和高脂飲食組（每組各40只），分別飼以正常飼料和高脂飼料。喂養(yǎng)10周后，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)以鑒定 IR模型是否成功。待模型建立后，再次將正常飲食組隨機(jī)分為正常飲食安靜組（NC）和正常飲食運(yùn)動(dòng)組（NE）；高脂飲食組隨機(jī)分為高脂飲食安靜組（HC）和高脂飲食運(yùn)動(dòng)組（HE）；

3、>　?。?）運(yùn)動(dòng)方案：各運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行為期6周、75％VO2max強(qiáng)度的有氧跑臺(tái)訓(xùn)練，1次/天，60分/次，5天/周；
　?。?）檢測(cè)空腹血清胰島素值（FINs）：取材前禁食12小時(shí)，期間自由飲水，經(jīng)腹膜下注射利多咔引以麻醉動(dòng)物，采用摘眼球法取血約200μl，離心提取血清，ELISA法檢測(cè)FINs；
　?。?）口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）：小鼠禁食16小時(shí)后，分別稱量體重并記錄。后經(jīng)尾靜脈取血微量，采用小型血糖儀檢測(cè)空腹血

4、糖，并將該時(shí)間點(diǎn)的血糖值設(shè)定為T0。隨后根據(jù)體重（10μl/g）迅速給小鼠經(jīng)口腔灌注20%葡萄糖溶液，分別檢測(cè)灌注后T15，T30，T60，T120和T180Min各時(shí)間點(diǎn)的血糖值；
　?。?）采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞 Akt、AS160和GLUT4 mRNA的表達(dá)；
　?。?）采用Western blot法檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞 Akt、AS160、GLUT4、Akt-Ser473磷酸化（pAkt-Ser47

5、3）和AS160-Thr642磷酸化（pAS160-Thr642）蛋白的表達(dá)；
　?。?）采用免疫熒光法（IF）檢測(cè)骨骼肌組織 Akt、AS160、GLUT4、pAkt-Ser473和pAS160-Thr642的表達(dá)和定位：取骨骼肌組織，依次經(jīng)4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，OCT包埋，冰凍切片，熒光免疫組織化學(xué)染色，共聚焦顯微鏡檢測(cè)各目的蛋白表達(dá)和定位。
　　結(jié)果：
　　（1）小鼠體重變化：HC組小鼠體重較 NC組

6、增高21.99%（P＜0.05）；HE組較HC組降低22.75%（P＜0.01）；
　　（2）FINs：飲食和運(yùn)動(dòng)之獨(dú)立效應(yīng)及飲食和運(yùn)動(dòng)之交互效應(yīng)對(duì)小鼠FINs均有顯著性影響。HC組小鼠FINs比NC組高77.19%（P<0.01）；而HE組比HC組FINs降低25.33%（P<0.05）；
　?。?）OGTT：高脂飲食組中，HC組小鼠OGTT的峰值比NC組明顯升高，且出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)也明顯后移，血糖濃度在葡萄糖灌注T30 Mi

7、n恢復(fù)速度遲緩，至T180 Min時(shí)仍顯著高于基礎(chǔ)值。HE組與HC組相比，OGTT峰值明顯下降，出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)前移，隨后血糖值也顯著下降，但在T180 Min時(shí)仍高于基礎(chǔ)值；
　?。?）骨骼肌細(xì)胞Akt2 mRNA和Akt蛋白及pAkt-Ser473蛋白表達(dá)：HC組小鼠骨骼肌細(xì)胞Akt2 mRNA（79.49±4.95 vs100.00, P<0.01）和蛋白（84.77±4.94 vs100.00, P<0.01）及pAkt-Se

8、r473（81.53±6.36 vs100.00, P<0.01）表達(dá)顯著低于NC組，而HE組小鼠骨骼肌細(xì)胞Akt2 mRNA（92.2±4.49 vs79.49±4.95, P<0.01）和蛋白（94.63±4.67 vs84.77±4.94, P<0.05）及pAkt-Ser473（98.82±4.80 vs84.77±4.64, P<0.05）表達(dá)顯著高于HC組。免疫熒光檢測(cè) Akt蛋白和pAkt-Ser473表達(dá)趨勢(shì)與Weste

9、rn blot檢測(cè)結(jié)果基本一致；
　　（5）骨骼肌細(xì)胞AS160 mRNA和蛋白及pAS160-Thr642蛋白表達(dá)：HC組AS160 mRNA（107.89±9.44 vs100.00, P>0.05）和蛋白（109.25±8.00 vs100.00, P>0.05）與 NC組無明顯變化，而 pAS160-Thr642蛋白（69.62±7.44 vs100.00±0.00, P<0.001）的表達(dá)顯著低于NC組；HE組AS160

10、 mRNA（105.53±7.59 vs107.89±9.44, P>0.05）和蛋白（102.22±3.36 vs109.25±8.00, P>0.05）的表達(dá)較HC組也無顯著性差異，但pAS160-Thr642蛋白（85.18±6.94 vs69.62±7.44, P<0.01）的表達(dá)顯著增加。免疫熒光檢測(cè) AS160和pAS160-Thr642蛋白表達(dá)結(jié)果支持Western blot檢測(cè)結(jié)果；
　?。?）骨骼肌細(xì)胞GLUT4

11、 mRNA和蛋白的表達(dá)：HC組GLUT4 mRNA（74.46±5.69 vs100.00, P<0.001）和蛋白（71.56±9.35 vs100.00, P<0.001）的表達(dá)明顯低于 NC組，而 HE組 GLUT4 mRNA（95.20±7.19 vs74.46±5.69, P<0.01）和蛋白（85.51±4.54 vs71.56±3.90, P<0.05）顯著高于在HC組小鼠骨骼肌組織中的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　

12、1．Akt/AS160信號(hào)傳導(dǎo)通路與高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠IR的發(fā)生密切相關(guān)；
　　2．有氧運(yùn)動(dòng)明顯增強(qiáng) IR小鼠骨骼肌細(xì)胞 Akt、pAkt-Ser473和pAS160-Thr642的表達(dá)，并且顯著提高IR小鼠骨骼肌細(xì)胞GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)。由此推斷，有氧運(yùn)動(dòng)可能是通過增強(qiáng)Akt/AS160信號(hào)傳導(dǎo)的活性，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高了骨骼肌組織中葡糖糖的代謝水平。
　　3．6周有氧運(yùn)動(dòng)可以顯