鼻咽癌干細(xì)胞的初步研究.pdf

1、腫瘤組織中的腫瘤細(xì)胞存在功能上的異質(zhì)性，只有一小群腫瘤干細(xì)胞能形成腫瘤，大部分細(xì)胞為非腫瘤干細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞生成腫瘤時，分裂產(chǎn)生大量的非腫瘤干細(xì)胞，重建腫瘤組織的異質(zhì)性。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。腫瘤干細(xì)胞可能來源與正常組織干細(xì)胞的突變。分離和鑒定腫瘤干細(xì)胞成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。 與EB病毒感染相關(guān)的鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)是高發(fā)于我國南方及東南亞地區(qū)的鼻咽部低分化鱗癌，雖然鼻咽癌的

2、研究有了極大的進(jìn)展，其5年生存率仍徘徊于50-60％，并未得到根本性的改善。導(dǎo)致鼻咽癌治療失敗的主要原因是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)。鼻咽癌是否存在腫瘤干細(xì)胞，尚無文獻(xiàn)報道，本實(shí)驗(yàn)將對此進(jìn)行探討。 目前腫瘤干細(xì)胞的研究多借鑒于正常干細(xì)胞的標(biāo)志物。造血干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞能將熒光染料Hoechst33342泵出細(xì)胞外，在流式細(xì)胞儀中顯示為小群側(cè)群(sidepopulaion，SP)細(xì)胞。研究表明，側(cè)群細(xì)胞的大部分細(xì)胞為造血干細(xì)胞，而且

3、，Hoechst染料的泵出是通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG的作用產(chǎn)生。我們對鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，顯示NPC中ABCG2+細(xì)胞的含量為1-2％，與文獻(xiàn)報道的實(shí)體瘤細(xì)胞中SP細(xì)胞為1％-20％相似。為此，我們擬通過分離鼻咽癌細(xì)胞株中的ABCG2+細(xì)胞，檢測其在裸鼠體內(nèi)成瘤能力，探討鼻咽癌細(xì)胞株中ABCG2+細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特征。 第一章NPC細(xì)胞株中ABCG2+與ABCG2-細(xì)胞的分選、鑒定及其成瘤

4、能力的比較 1.NPC細(xì)胞株中ABCG2+與ABCG2-細(xì)胞的分選和鑒定 細(xì)胞分選技術(shù)，國外多用流式細(xì)胞儀(FACS)，國內(nèi)絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀欠先進(jìn)，分選低含量的細(xì)胞時，分選時間長，降低細(xì)胞的活性、難以保證無菌，影響以后的裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)。因此，我們選用免疫磁珠細(xì)胞分選器(MACS)分選NPC細(xì)胞株中的ABCG2+細(xì)胞。用PE-ABCG2單克隆抗體標(biāo)記未分離的NPC細(xì)胞株細(xì)胞，免疫磁珠細(xì)胞分選器分選PE-ABCG2+細(xì)胞

5、，每1x107個NPC細(xì)胞可分離獲得ABCG2+細(xì)胞3x104個，陽性細(xì)胞的回收率為30％。流式細(xì)胞儀顯示分離的ABCG2+細(xì)胞的熒光值較ABCG2-細(xì)胞的熒光值高，ABCG2+細(xì)胞的熒光峰值較ABCG2-細(xì)胞的熒光峰值明顯右移。實(shí)時定量PCR檢測分離的ABCG2+細(xì)胞與ABCG2-細(xì)胞中ABCG2mRNA的含量，證實(shí)ABCG2+細(xì)胞中ABCG2mRNA量較ABCG2-細(xì)胞的高6-9倍，說明磁珠分選ABCG2+細(xì)胞可靠。 2.N

6、PC細(xì)胞株中ABCG2+與ABCG2-細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤性的比較 鑒定腫瘤干細(xì)胞必需證明它是唯一能生成腫瘤的細(xì)胞，裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)是目前檢測腫瘤干細(xì)胞的最重要指標(biāo)。我們對5-8F和6-10B中分離的ABCG2+細(xì)胞進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)的成瘤能力的觀察。首先，以1x102、1x103、1x104、1x105、1x106的5-8F及6-10B細(xì)胞裸鼠皮下注射，只有細(xì)胞數(shù)1x105以上才能生成移植瘤，1x104以下的細(xì)胞數(shù)不能成瘤。因此，將

7、5-8F和6-10B的ABCG2+細(xì)胞與ABCG2-細(xì)胞分別以每位點(diǎn)2x103接種于裸鼠皮下，觀察17-18周結(jié)果顯示：ABCG2+組二周后開始成瘤，成瘤率為6/20；ABCG2-組未見成瘤，成瘤率為0/20；6-10B細(xì)胞ABCG2+組注射10個位點(diǎn)，二周后開始成瘤，共成瘤3個，成瘤率3/10；ABCG2-組未見成瘤，成瘤率0/10。說明ABCG2+細(xì)胞是5-8F和6-10B細(xì)胞中能在裸鼠體內(nèi)成瘤的細(xì)胞，ABCG2-細(xì)胞沒有或具有較低

8、的成瘤能力，ABCG2+細(xì)胞較未分離的NPC細(xì)胞株成瘤能力強(qiáng)50倍。將ABCG2+細(xì)胞種至裸鼠體內(nèi)形成移植瘤后分離呈單細(xì)胞，PE熒光標(biāo)記ABCG2，流式細(xì)胞儀顯示ABCG2+細(xì)胞為1％；磁珠分選其中的ABCG2+細(xì)胞，從1x107腫瘤細(xì)胞中，只能獲得的ABCG2+細(xì)胞3x104，絕大部分為ABCG2-細(xì)胞，提示ABCG2+細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生成腫瘤時，產(chǎn)生了大量的ABCG2-細(xì)胞，重建了腫瘤細(xì)胞功能的異質(zhì)性。 第二章NPC細(xì)胞株中A

9、BCG2+與ABCG2-細(xì)胞的基因表達(dá)譜分析 1.6-10B與5-8F中成瘤相關(guān)基因的篩選 組織干細(xì)胞的芯片研究表明，成體干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞還有胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)譜存在共性，賦予這些細(xì)胞“干細(xì)胞性”。本實(shí)驗(yàn)對NPC細(xì)胞株中ABCG2+和ABCG2-組細(xì)胞進(jìn)行了Affymetrix芯片的基因表達(dá)譜分析。重點(diǎn)比較ABCG2+細(xì)胞與ABCG2-細(xì)胞的差異基因，篩查與ABCG2+細(xì)胞成瘤相關(guān)的基因。 2，N

10、PC成瘤相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析 MILANO軟件分析篩出的NPC成瘤相關(guān)的19個基因顯示：PGK1、DICER1、FGFR1、PGF、PCBP2、PDE4C、EIF4A1、SRRM2、NFAT5、RPL38、RUFY2、SMA4等12個基因參與了胚胎和器官發(fā)育與分化功能。另外7個基因未見文獻(xiàn)報道與干細(xì)胞功能相關(guān)，它們可能是新發(fā)現(xiàn)的參與干細(xì)胞功能的基因。本實(shí)驗(yàn)中，5-8F中，ABCG2+細(xì)胞較ABCG2-細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)的基因在三組

11、5-8F共同存在的3個基因里，其中基因CTTN的差異表達(dá)倍數(shù)顯著(26倍)，而且該基因在6-10B的ABCG2+細(xì)胞中不表達(dá)。文獻(xiàn)報道CTTN基因與腫瘤的轉(zhuǎn)移和干細(xì)胞的遷移功能密切相關(guān)，它是否是賦予5-8F的ABCG2+細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能的關(guān)鍵基因，值得進(jìn)一步研究。 3，6-10B與5-8F中ABCG2+表達(dá)降低的基因的篩選和生物信息學(xué)分析 交集分析顯示：在三組6-10B細(xì)胞中ABCG2+細(xì)胞較ABCG2-細(xì)胞共同表達(dá)降低的基

12、因14個，至少在兩組細(xì)胞中共同表達(dá)降低的基因有193個基因。在5-8F中ABCG2+細(xì)胞較ABCG2-細(xì)胞至少在兩組5-8F細(xì)胞中表達(dá)降低的基因有3個。這些基因可能降低了NPC細(xì)胞的成瘤能力。Gostat軟件對6-10B、5-8F中ABCG2+細(xì)胞較ABCG2-細(xì)胞表達(dá)降低的201個基因進(jìn)行生物過程功能分類分析，顯示這些基因與ABCG2+細(xì)胞中上調(diào)的226個基因的區(qū)別主要是細(xì)胞因子與受體相關(guān)、信號蛋白通路相關(guān)基因較少，代謝相關(guān)基因多，并

13、有凋亡誘導(dǎo)基因。 總之，實(shí)體腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)無疑給全世界學(xué)者一個很大的驚喜。我們也試圖分離出NPC中的腫瘤干細(xì)胞并對其進(jìn)行系統(tǒng)的研究，探討腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，為進(jìn)一步分離和鑒定NPC實(shí)體瘤中的腫瘤干細(xì)胞提供方法和路徑；從腫瘤干細(xì)胞角度研究NPC發(fā)病機(jī)理和尋找NPC治療靶點(diǎn)是我們努力的方向。 結(jié)論： 1，鼻咽癌細(xì)胞株中存在ABCG2+細(xì)胞，其含量恒定而量微，約為1-2％。 2，ABCG2+細(xì)胞是NPC腫

14、瘤細(xì)胞株中生成腫瘤的細(xì)胞，而ABCG2-細(xì)胞無生成腫瘤的能力或成瘤能力低。 3，ABCG2+細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生成的腫瘤組織中，只有1％的子代細(xì)胞是ABCG2+細(xì)胞，大部分為ABCG2-細(xì)胞，ABCG2+細(xì)胞重建了腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。 4，基因表達(dá)譜分析，篩選出鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B中ABCG2+細(xì)胞較ABCG2-細(xì)胞共同表達(dá)增強(qiáng)的明晰基因19個，可能在NPC腫瘤細(xì)胞成瘤性方面起重要作用。 5，篩選出ABCG