耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥性及分子耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的： 銅綠假單胞菌(Pa)為條件致病菌，是引起院內(nèi)感染最常見的病原菌之一。近年來隨著β-內(nèi)酰胺類、免疫抑制劑、腫瘤化療藥物的廣泛應(yīng)用，由該菌引起的院內(nèi)感染率逐年上升，對抗生素的耐藥性也呈逐年上升趨勢，臨床治療日趨困難。喹諾酮類抗生素是唯一可與β-內(nèi)酰胺類相媲美的合成抗菌藥物，以環(huán)丙沙星為代表，因其良好的藥代動力學(xué)特點(diǎn)，強(qiáng)大的殺菌活性廣泛應(yīng)用于臨床銅綠假單胞菌感染的治療，隨著該類藥物的大量使用，銅綠假單胞菌對喹諾酮類的耐藥率不斷

2、上升。本研究對廣州地區(qū)的耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥性、耐藥相關(guān)基因的突變、部分外膜蛋白等進(jìn)行研究，并結(jié)合其流行病學(xué)特征，初步探討銅綠假單胞菌耐喹諾酮類抗生素的分子耐藥機(jī)制，為指導(dǎo)臨床合理使用抗生素以及控制耐藥菌株的傳播提供科學(xué)依據(jù)。 方法： 1．選擇103株臨床分離的的非重復(fù)的銅綠假單胞菌，用VITEK-2系統(tǒng)測定其對18種常用抗生素的MIC，對藥物敏感性進(jìn)行分析。并篩選出耐喹諾酮類銅綠假單胞菌。 2．采用IA

3、TS分型血清對菌株進(jìn)行血清學(xué)分型，了解廣州地區(qū)喹諾酮耐藥銅綠假單胞菌的血清型別分布情況，結(jié)合耐藥譜分析，建立從表型上簡單快速的判定菌株流行情況的方法。 3．采用PCR方法擴(kuò)增第二類拓?fù)洚悩?gòu)酶gyrA、gyrB、parC和parE基因的喹諾酮藥物耐藥決定區(qū)(QRDR)片段，分別對gyrA、parC基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析，檢測銅綠假單胞菌gyrA基因和parC基因的突變，

4、并對部分菌株的gyrB基因和parE基因的核昔酸序列進(jìn)行測定，探討基因突變與銅綠假單胞菌對喹諾酮類耐藥性的關(guān)系。 4．采用外排泵抑制劑碳酰氰基-對-氯苯腙(CCCP)對菌株進(jìn)行作用，觀察其降低喹諾酮類抗生素MIC、減少其主動外排的作用；同時提取Pa的外膜蛋白，并用SDS-PAGE對外膜蛋白進(jìn)行分析，探討其與耐藥性的關(guān)系。結(jié)論： 1．廣州地區(qū)環(huán)丙沙星耐藥銅綠假單胞菌對多種抗生素呈多重耐藥和交叉耐藥。對于這些菌株感染的治療，

5、可選擇哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林等藥物。 2．銅綠假單胞菌的血清學(xué)分型方法，可以快速、簡單地監(jiān)測這些菌株的院內(nèi)感染流行情況。 3．gyrA基因第83位氨基酸密碼子突變是銅綠假單胞菌對喹諾酮類耐藥的主要耐藥機(jī)制，同時合并發(fā)生gyrB、parC或parE基因突變可提高菌株的耐藥水平。PCR-RFLP方法可以快速簡便地檢測出耐喹諾酮類銅綠假單胞菌gyrA基因第83位氨基酸密碼子突變株和parC基