Oct3-4及Bcl-2在氣管干細(xì)胞增殖分化過(guò)程中的表達(dá)及意義.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模焊杉?xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體，按照組織發(fā)生學(xué)來(lái)源干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞是指?jìng)€(gè)體發(fā)育到一定階段甚至成體，仍存在的一小部分未成熟、未分化細(xì)胞，負(fù)責(zé)組織的更新和修復(fù)。那么干細(xì)胞為什么能具有多分化，維持未分化狀態(tài)呢?其機(jī)理尚不清楚。在胚胎干細(xì)胞研究中，有人發(fā)現(xiàn)Oct3/4在維持其未分化狀態(tài)中起重要作用。Oct3/4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)，在分化細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)。B

2、cl-2是經(jīng)典的抗凋亡因子，能抑制增殖細(xì)胞的凋亡，延長(zhǎng)非增殖細(xì)胞的存活時(shí)間。為了探討氣管干細(xì)胞多分化潛能和保持未分化狀態(tài)的分子機(jī)理，本研究采用5-FU制成人支氣管、大鼠氣管上皮損傷修復(fù)模型，觀察氣管干細(xì)胞在增殖、分化過(guò)程中Oct3/4、Bcl-2表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，探討其表達(dá)意義。 實(shí)驗(yàn)材料和方法：1.制備離體大鼠氣管損傷模型：250克左右Wistar大鼠，雌雄不限(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，腹腔注射10％水合氯醛0.4ml/

3、100g，無(wú)菌條件下取出氣管，剪成約3mm的氣管環(huán)，倒置顯微鏡下觀察纖毛擺動(dòng)良好，取一組織塊作正常對(duì)照。于DMEM/F12中加入5-FU，終濃度為120mg/ml，將大鼠氣管環(huán)置于其中，CO2孵箱孵育12小時(shí)，換新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、3、6、9、12、24、48、72小時(shí)取出一塊組織固定，石蠟包埋，制成3μm厚的組織切片。另取換液后0、3、9、24、48小時(shí)的氣管組織及正常氣管組織，解剖顯微鏡下機(jī)械剝離上皮，每

4、個(gè)樣品約0.1克，放于1.5mlEppendorf管中，-70℃保存。 2.制備離體人支氣管損傷模型：標(biāo)本均取自因肺癌手術(shù)切除肺葉組織，取癌旁3cm外肺組織的支氣管(經(jīng)家屬及中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意)，處理步驟同大鼠。分別于換液后0、3、9、24、48小時(shí)取出組織塊固定、包埋、制成3μm厚的組織切片。3.HE染色：光鏡下觀察結(jié)果。 4.免疫組織化學(xué)染色：采用SP法，一抗用Santa公司濃縮型Oct3/4抗體(1：100

5、)，DAB顯色，PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。 5.間接免疫熒光雙染檢測(cè)Bcl-2、ABCG2的表達(dá)：采用兩步法，第一抗體為ABCG2(1：100)，TRITC標(biāo)記的IgG；第二抗體為Bcl-2(1：100)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的IgG。DAPI復(fù)染細(xì)胞核。甘油封片，分別用PBS代替第一、第二抗體作為陰性對(duì)照。 6.Westernblotting檢測(cè)Oct3/4、Bcl-2的表達(dá)：取各時(shí)段氣管上皮組織，提取總蛋白。每孔蛋白上

6、樣總量均為20μg。小鼠抗Oct3/4、兔抗Bcl-2抗體(1：400)，過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、過(guò)氧化物酶小鼠抗兔IgG(1：1000)，DAB顯色。β-actin為內(nèi)對(duì)照。 結(jié)果：氣管上皮損傷修復(fù)過(guò)程中HE染色、Oct3/4免疫組織化學(xué)法、Bcl-2間接免疫熒光結(jié)果：正常氣管上皮為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，已分化細(xì)胞中無(wú)Oct3/4表達(dá)，Bcl-2表達(dá)極微弱；5-FU作用12小時(shí)后，氣管基底膜上僅殘留間隔分布的G0期細(xì)胞，

7、其中Oct3/4、Bcl-2均開(kāi)始有明顯表達(dá)；恢復(fù)3-6小時(shí)，極扁平細(xì)胞漸扁平，胞核狹長(zhǎng)，胞漿稀少；恢復(fù)9-12小時(shí)扁平細(xì)胞逐漸變立方，胞漿增加，細(xì)胞數(shù)增加，此期間Oct3/4、Bcl-2在上皮細(xì)胞中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，二者的表達(dá)均在9-12小時(shí)達(dá)到高峰；恢復(fù)24小時(shí)，上皮細(xì)胞出現(xiàn)纖毛結(jié)構(gòu)，這是明顯的分化標(biāo)志，此時(shí)Oct3/4表達(dá)明顯減少；恢復(fù)48小時(shí)后，只有散在的個(gè)別細(xì)胞為Oct3/4陽(yáng)性。Bcl-2在恢復(fù)12小時(shí)后的上皮細(xì)胞中表達(dá)減少

8、，與Oct3/4相比Bcl-2表達(dá)的下降較為緩和，直至恢復(fù)48小時(shí)仍有Bcl-2的少量表達(dá)。 Oct3/4、Bcl-2Westernblotting結(jié)果與上述免疫組織化學(xué)及免疫熒光的結(jié)果相一致。 結(jié)論：1.氣管干細(xì)胞中含有Oct3/4。在氣管干細(xì)胞出現(xiàn)的早期，Oct3/4表達(dá)，隨著干細(xì)胞的分化其表達(dá)逐漸減少。提示Oct3/4在保持氣管干細(xì)胞多潛能、未分化狀態(tài)起重要作用。 2.Bcl-2在氣管干細(xì)胞增殖早期表達(dá)，隨