gtfB反義寡核苷酸抑制變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶的研究.pdf

1、反義寡核苷酸(Antisenseoligodeoxyribonucleotide，AS-ODN)以堿基配對的形式，借助氫鍵結(jié)合至其互補(bǔ)序列，抑制靶基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而調(diào)節(jié)遺傳信息由基因到蛋白質(zhì)間的傳遞，與生物基因的表達(dá)、調(diào)控密切有關(guān)。該方法直接利用目標(biāo)基因核苷酸序列信息設(shè)計(jì)反義序列，并依靠其高度的序列專一性，特異的使靶基因沉默或表達(dá)下調(diào)，能夠明確靶基因的功能，并達(dá)到治療效果，已經(jīng)廣泛用于腫瘤、病毒感染、器官移植排斥反應(yīng)等疾病的治療研

2、究。反義技術(shù)操作簡單，高效、快速、低毒，并且實(shí)驗(yàn)周期短，可進(jìn)行高通量篩選分析，具有明顯的量效關(guān)系，可作為候選藥物。雖然反義現(xiàn)象天然存在于原核細(xì)胞中，但是細(xì)菌細(xì)胞壁妨礙AS-ODN進(jìn)入細(xì)胞中，胞漿中不能達(dá)到有效濃度，限制了它在原核細(xì)胞中的應(yīng)用。隨著對AS-ODN進(jìn)行化學(xué)修飾的不斷改進(jìn)及載體研究的發(fā)展，AS-ODN的穩(wěn)定性和通過細(xì)胞壁的能力有了極大地提高，已成功用于下調(diào)細(xì)菌毒力因子、抗性基因和基礎(chǔ)基因的表達(dá)，降低了細(xì)菌的毒性，增加了細(xì)菌對抗

3、菌藥物的敏感性，抑制了細(xì)菌的生長。靶向細(xì)菌毒力因子的AS-ODN僅作用于單一病原菌(或限于幾種病原菌)，有利于減少對宿主細(xì)胞的副作用，并減緩抗性生成。 齲病是細(xì)菌感染性疾病，發(fā)病率高、流行范圍廣，嚴(yán)重影響患者的全身健康和生活質(zhì)量，WHO將其列為三大重點(diǎn)防治疾病之一。長期以來，經(jīng)學(xué)者們及廣大醫(yī)務(wù)工作者的努力，齲病預(yù)防收到了明顯的效果，尤其是氟化物的使用，使齲病患病率明顯降低。然而現(xiàn)有的預(yù)防措施未能完全控制齲病的發(fā)生；氟化物的長期使

4、用，還導(dǎo)致了耐氟菌株的產(chǎn)生；隨著社會老齡化，越來越多的人面臨根面齲的威脅；廣泛存在的細(xì)菌耐藥性，加劇了目前的形勢，迫切需要人們開發(fā)新的預(yù)防措施及藥物。 變形鏈球菌(S.mutans)是齲病的主要致病菌，它的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTFs)利用食物中的蔗糖和葡萄糖合成水溶性和水不溶性葡聚糖，調(diào)節(jié)細(xì)菌粘附至牙面及細(xì)菌間的聚集，是齲病的始動因素。因而編碼GTFs的基因成為預(yù)防齲病的重要靶目標(biāo)。gtfB編碼合成水不溶性葡聚糖的GTF-I，是S.

5、mutans的主要毒力因子之一，體內(nèi)、外多項(xiàng)研究證實(shí)了它在齲病發(fā)病中的重要作用。利用AS-ODN抑制gtfB表達(dá)有可能成為齲病病因研究和齲病預(yù)防的新方法，本研究擬就此進(jìn)行可行性探索。 研究內(nèi)容：1、根據(jù)S.mutansGS5gtfB基因序列和蛋白質(zhì)功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，尊照AS-ODN設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)AS-ODN兩條，錯(cuò)配序列一條。為保證AS-ODN的穩(wěn)定性，將其骨鏈進(jìn)行硫代磷酸化修飾(分別命名為PS-ODN1和PS-ODN2，錯(cuò)配序

6、列命名為PS-ODN3)。隨機(jī)選擇PS-ODN2，以FITC標(biāo)記，優(yōu)化AS-ODN轉(zhuǎn)化條件，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。 2、采用適當(dāng)?shù)妮d體，將gtfBPS-ODN轉(zhuǎn)入S.mutans細(xì)胞內(nèi)，RT-PCR，SDS-PAGE結(jié)合灰度掃描，原位酶活性檢測及水不溶性多糖合成定量測量觀察gtfB表達(dá)情況。 3、檢測gtfB反義PS-ODNs對S.mutans生物學(xué)行為的影響：①體外粘附法觀察gtfB反義PS-ODNs對S.mutans蔗

7、糖依賴性粘附的影響；②體外生物膜模型觀察gtfB反義PS-ODNs對S.mutans生物膜形成能力的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.①比較游離PS-ODN、脂質(zhì)體2000包裹的PS-ODN、與陽離子聚合體So-fastTM結(jié)合的PS-ODN及電穿孔導(dǎo)入PS-ODN的效率，發(fā)現(xiàn)陽離子聚合體和電穿孔均能顯著提高S.mutans對PS-ODN的攝取效率。②PS-ODN濃度為5μmol/L，時(shí)間為2hr時(shí)，細(xì)胞的攝取效率已達(dá)峰值，繼續(xù)增加濃度或轉(zhuǎn)

8、化時(shí)間，并不能使攝取效率繼續(xù)增加。③選擇So-fastTM為載體，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 2.①轉(zhuǎn)化反義PS-ODNs后1hr和2hr，S.mutansgtfBmRNA水平在各處理組間無明顯差異。然而，轉(zhuǎn)化后8hr，PS-ODN1和PS-ODN2使gtfBmRNA水平明顯降低，錯(cuò)配鏈PS-ODN3僅表現(xiàn)出微弱的抑制作用，So-fastTM沒有抑制作用。②反義PS-ODNs抑制S.mutansGTF-I表達(dá)(P＜0.01)，PS-ODN1

9、，PS-ODN2和PS-ODN3分別使其表達(dá)減少41.32％，41.94％和17.88％；PS-ODN1和PS-ODN2的抑制效果無差別(P＞0.05)；PS-ODN3和So-fastTM不影響GTF-I表達(dá)(P＞0.05)。③PS-ODN1及PS-ODN2使S.mutansGTF-I合成的水不溶性葡聚糖減少，酶活性降低。PS-ODN3，So-fas，M對水不溶性葡聚糖的合成影響不明顯。④經(jīng)反義PS-ODNs處理，S.mutans水不溶

10、性葡聚糖合成量顯著降低(P＜0.05)，PS-ODN1與PS-ODN2之間及各對照組間無明顯差別(P＞0.05)。 3.①PS-OND1和PS-OND2抑制S.mutans蔗糖依賴性粘附(P＜0.01)，它們分別使細(xì)菌粘附減少31.4％及41.8％，但兩者間差異不顯著(P＞0.05)。②PS-ODN處理可改變S.mutans所形成的生物膜結(jié)構(gòu)。游離反義PS-ODN使生物膜厚度、密度及細(xì)胞數(shù)明顯減少，生物膜內(nèi)間隙增大，數(shù)目增多，可

11、看到變形鏈球菌細(xì)胞形成的長鏈交錯(cuò)，構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。與So-fastTM結(jié)合的反義PS-ODN抑制生物膜形成的方式與游離反義PS-ODN一致，但效果更為顯著。So-fastTM對生物膜形成的影響不大；對照PS-ODN也有輕微的抑制作用。③PS-ODNs，So-fastTM對S.mutans生長沒有影響。 結(jié)論：1.陽離子聚合體So-fastTM可以顯著促進(jìn)PS-ODN通過S.mutans細(xì)胞壁，5μmol/L2hr可使細(xì)胞攝取效率

12、達(dá)到飽和。 2.轉(zhuǎn)化反義PS-ODN后，S.mutansgtfBmRNA水平下降、GTF-I合成減少、酶活性降低及水不溶性葡聚糖合成減少，說明反義序列設(shè)計(jì)合理，能結(jié)合至同源靶序列，下調(diào)靶基因表達(dá)。 3.gtfB反義PS-ODN抑制S.mutans蔗糖依賴性粘附，證實(shí)GTF-I與S.mutans體外粘附有關(guān)。 4.體外生物膜模型檢測各處理組生物膜形成能力的結(jié)果表明，下調(diào)gtfB基因表達(dá)，可改變S.mutans生物膜

13、結(jié)構(gòu)，說明GTF-I與生物膜形成相關(guān)。 5.游離反義PS-ODN抑制S.mutans生物膜形成的能力小于與So-fastTM結(jié)合的反義PS-ODN，So-fastTM本身對生物膜形成沒有明顯影響，說明So-fastTM載體選擇恰當(dāng)，可使細(xì)胞內(nèi)反義PS-ODN有效濃度升高，反義活性增強(qiáng)。 6.錯(cuò)配序列和So-fasTM對S.mutansgtfB表達(dá)和生物學(xué)行為無顯著影響。各PS-ODN和So-fastTM對S.mutans