新型組蛋白去乙?；敢种苿┑脑O計、合成及抗腫瘤活性研究.pdf

1、本研究論文是以在生物表觀遺傳學研究過程中發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移以及腫瘤組織新生血管生成密切相關的生物靶標組蛋白去乙?；?HDACs)為作用靶點，設計合成了三個系列共計109個具有全新骨架結構的HDACs抑制劑，并對其進行了體內外生物活性評價和構效關系討論。全文共分為五個部分進行分章論述。
　　 一.研究背景
　　 腫瘤(tumor)是僅次于心腦血管疾病的嚴重威脅人類生命健康的第二大殺手。目前，我國惡性腫瘤的發(fā)病率

2、以每年2.5％的速度增長，死亡率每年遞增約1.3％。
　　 組蛋白去乙?；?HDACs)是一類催化各種底物（如核小體組蛋白）賴氨酸殘基末端的乙?；獾牡鞍酌讣易濉Ｄ壳鞍l(fā)現(xiàn)的人源HDACs包括4個亞族共18個亞型。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，許多HDACs家族成員的表達和活性在多種腫瘤病例中都有上調的表現(xiàn)，這表明HDACs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。近來，越來越多的研究表明，HDACs通過使組蛋白末端的賴氨酸殘基去乙酰化來抑制基因

3、轉錄，并通過去乙?；喾N非組蛋白而影響蛋白質的穩(wěn)定性和定位、蛋白質-DNA相互作用及蛋白質-蛋白質相互作用，這其中很多效應都會促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。HDACs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中主要起以下幾方面的作用:1.促進腫瘤細胞增殖和侵襲遷移;2.促進腫瘤組織新生血管生成;3.增強腫瘤細胞對放療化療藥物的耐藥性;4.抑制腫瘤細胞分化和凋亡等。
　　 隨著HDACs與腫瘤密切關系的逐步闡明，越來越多的HDACs抑制劑顯示出了高效的體內外抗

4、腫瘤活性和多重的抗腫瘤作用機制，如:誘導腫瘤細胞凋亡和自噬、引起腫瘤細胞周期阻滯、抑制腫瘤細胞血管生成、降低腫瘤細胞的運動性和遷移能力、增強腫瘤細胞對放療和化療的敏感性、降低腫瘤細胞DNA的自我修復能力等。迄今為止，已有兩個HDACs抑制劑（SAHA和FK228）被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用于治療皮膚T細胞淋巴瘤。此外，目前還有十余種HDACs抑制劑進入了臨床研究，用于淋巴瘤，實體瘤和其它血液系統(tǒng)腫瘤的治療。因此，尋找高效、

5、低毒的小分子HDACs抑制劑已成為當前國內外抗癌領域的研究熱點。
　　 雖然已知的HDACs抑制劑的結構類型豐富多樣，但絕大部分抑制劑都符合一個通用的藥效團模型，該藥效團模型主要分為三部分:分別位于兩端的鋅離子螯合基團(ZBG)和酶表面識別區(qū)域(SurfaceRecognitionDomain)，以及將以上兩部分連接起來的適當長度的疏水性長鏈(Linker)。本論文根據(jù)已知的HDACs抑制劑的藥效團模型和酶活性位點結構信息，合理

6、設計、定向合成具有全新結構的HDACs抑制劑，從中篩選、優(yōu)化得到具有體內外抗腫瘤活性的先導化合物，為進一步開發(fā)具有我國自主知識產權的創(chuàng)新性抗腫瘤藥物奠定基礎。
　　 二.以四氫異喹啉-3-羧酸為骨架結構的異羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿┑脑O計、合成及抗腫瘤活性研究
　　 針對HDACs抑制劑藥效團模型的三個部分進行結構改造是獲得HDACs抑制劑的有效策略之一。本部分將構象限定這一經典策略用于HDACs抑制劑疏水性長鏈(L

7、inker)的結構改造當中。通過對化合物進行構象限定，一方面可以獲得化合物的藥效構象，提高化合物對其作用靶點的分子識別作用，降低由于化合物脫靶而引起的毒副作用;另一方面可以一定程度上提高化合物的代謝穩(wěn)定性。這都有利于獲得高效、低毒、代謝穩(wěn)定的HDACs抑制劑。
　　 通過文獻調研，我們發(fā)現(xiàn)1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸（簡稱Tic）是一種具有獨特幾何構象和生物活性的非天然α。氨基酸。Tic的結構片段被用于許多活性化合物的設

8、計與合成。本部分創(chuàng)新性地將Tic片段引入HDACs抑制劑藥效團結構中的Linker部分，結合計算機輔助藥物設計手段，經過幾輪的活性評價篩選（體外抑酶活性篩選、體外抗腫瘤細胞增殖活性篩選和動物體內抑瘤活性篩選）和結構優(yōu)化改造，共設計合成66個四氫異喹啉-3-羧酸系列的HDACs抑制劑，化學結構經過1HNMR、HRMS和IR確證，活性優(yōu)秀的化合物的純度經HPLC測試大于等于95％。經查閱文獻證實，所合成的目標化合物均為新型化合物，未見文獻或

9、專利報道。
　　 考慮到各種Zn2+依賴性HDACs亞型的活性位點具有高度的保守性，而HDAC8的活性位點晶體結構已知，我們首先采用HDAC8作為酶源對目標化合物進行篩選，對抑酶活性較好的化合物進一步進行體外抗腫瘤細胞增殖活性篩選和動物體內抑瘤活性篩選。絕大多數(shù)目標化合物的體外抑酶活性優(yōu)于己上市的陽性對照藥SAHA，部分目標化合物對多株腫瘤細胞具有顯著的抗增殖活性，其中化合物13e，22a和22c顯示出與陽性對照藥SAHA相當甚

10、至更強的裸鼠體內抗人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)、抗人結腸癌細胞(HCT116)增殖活性和雜種鼠體內抗肝癌細胞(H22)肺轉移活性。本系列活性最強的化合物22c，由于其明顯優(yōu)于SAHA的體內外抗腫瘤活性，己被作為抗癌候選藥物進行臨床前研究與開發(fā)。
　　 三.以酪氨酸為骨架結構的異羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿┑脑O計、合成及抗腫瘤活性研究
　　 上述系列中設計得到的四氫異喹啉-3-羧酸系列HDACs抑制劑有效的HDA

11、Cs抑酶活性和體內外抗腫瘤活性激發(fā)了我們對其進行進一步結構改造和優(yōu)化的熱情。為了考察分子柔性對活性的影響，本章采用相對柔性的酪氨酸結構片段代替四氫異喹啉-3-羧酸系列HDACs抑制劑骨架結構中的剛性四氫異喹啉-3-羧酸結構片段。設計合成的13個酪氨酸系列化合物結構經過1HNMR和HRMS確證。經查閱文獻證實，所合成的目標化合物均為新型化合物，未見文獻或專利報道。
　　 我們首先對目標化合物進行了HDAC8的抑酶活性篩選和體外人乳

12、腺癌細胞(MDA-MB-231)、肺癌細胞(A549)和結腸癌細胞(HCT116)的抗增殖活性篩選，結果表明酪氨酸系列化合物與四氫異喹啉-3-羧酸系列化合物相比，有較強的HDAC8抑酶活性和較弱的抗腫瘤細胞增殖活性。其中，目標化合物Q1、Q2、Q3和Q4的HDAC8抑酶活性比SAHA強10倍以上。進一步的以HeLa細胞核提取物為酶源（主要含HDAC1和HDAC2）的測試結果表明，化合物Q1-Q4的活性明顯差于SAHA，這可能是該系列化合

13、物抗腫瘤細胞增殖活性較差的原因，因為研究表明HDAC1和HDAC2的活性與腫瘤細胞增殖密切相關。這些結果提示我們酪氨酸衍生物類HDACs抑制劑具有一定的HDAC8亞型選擇性，有希望進一步設計改造成為高選擇性的HDAC8選擇性抑制劑。
　　 四.以1，4-二硫-7-氮雜螺[4,4]壬烷-8-羧酸為骨架結構的直鏈異羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿┑脑O計、合成及抗腫瘤活性研究
　　 根據(jù)已知的HDACs抑制劑的藥效團模型，結合經

14、典的類肽化合物作為酶抑制劑的設計策略，我們設計了一系列直鏈類異羥肟酸化合物。我們將1，4-二硫-7-氮雜螺[4，4]壬烷-8-羧酸活性片段引入HDACs抑制劑藥效團模型的酶表面識別區(qū)域(SurfaceRecognitionDomain)，以考察該部分對化合物活性和選擇性的影響。合成得到的30個1，4-二硫-7-氮雜螺[4，4]壬烷-8-羧酸系列化合物結構均經過1HNMR和HRMS確證，部分代表性化合物結構經過13CNMR確證。經查閱文獻

15、證實，所合成的目標化合物均為新型化合物，未見文獻或專利報道。
　　 我們首先對目標化合物進行了HDAC8的抑酶活性篩選，結果表明該系列化合物普遍具有較強的HDAC8抑制活性。值得指出的是，目標化合物33f、331、341、33k、33m和33n的HDAC8抑酶活性明顯優(yōu)于上市藥物SAHA，其中化合物331和33k的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別達到0.021±0.004mmol和0.035±0.007mmol，然而該系列化合物的抗

16、腫瘤細胞增殖活性（人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7和人前列腺癌細胞PC-3）卻遠不及SAHA.后續(xù)的HDAC1抑酶活性測試結果提示我們，化合物331和33k具有一定的HDAC8亞型選擇性，可以作為先導化合物用來設計得到全新的具有亞型選擇性的HDACs抑制劑。
　　 五.全文總結與展望
　　 本課題綜合運用藥物化學、化學生物學、計算機化學等前沿學科的交叉，以當前抗腫瘤研究領域的熱點組蛋白去乙?；窰DACs為靶

17、標，合理設計、定向合成了三個系列共109個具有全新骨架結構的HDACs抑制劑。對所有目標化合物進行了分子水平的抑酶活性篩選，從中選取活性較好的化合物逐層進行細胞水平、動物水平的抗腫瘤活性測試，利用得到的構效關系信息對表現(xiàn)優(yōu)異的化合物進行進一步的結構改造、修飾和優(yōu)化。結果表明:四氫異喹啉-3-羧酸衍生物骨架結構可以用來設計、合成具有體內外抗腫瘤活性的廣譜HDACs抑制劑，目前得到的化合物22c的體內外抗腫瘤活性明顯優(yōu)于上市藥物SAHA，對