人源性天然單鏈抗體庫的構(gòu)建.pdf

1、抗體在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中起著重要的作用，被廣泛地運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)室研究、疾病的診斷與治療。噬菌體抗體庫技術(shù)為人單抗的制備開創(chuàng)了一個全新的技術(shù)領(lǐng)域，它使用聚合酶鏈延伸反應(yīng)(PCR)方法，把免疫球蛋白全套可變區(qū)基因擴(kuò)增出來，重組到原核表達(dá)載體中，并通過與噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白，使抗體片段表達(dá)于噬菌體表面，這樣可用類似親和層析的方法，篩選特異性的可變區(qū)基因。這樣就可以不經(jīng)過雜交瘤、甚至不經(jīng)過免疫就可獲得特異地結(jié)合不同抗原的抗體片段。本實(shí)驗(yàn)用PCR，從正

2、常人外周血中分離淋巴細(xì)胞，克隆出抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因，重組到表達(dá)載體中，構(gòu)建了人源性噬菌體抗體庫。 一、抗體輕、重鏈基因的擴(kuò)增。這一部分主要包括以下步驟：①淋巴細(xì)胞的分離②總RNA的提?、踡RNA的純化④反轉(zhuǎn)錄⑤PCR。結(jié)果：共提取出RNA640μg；mRNA的純化后得到7.2μg。經(jīng)過RT-PCR，VH，VL及VK的每一條5’端引物與其相應(yīng)的3’端引物都成功地擴(kuò)增出可變區(qū)基因片段。 二、載體酶切、連接、轉(zhuǎn)化條件的