耐氨基糖苷類銅綠假單胞菌的分子耐藥機(jī)制研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pae)是院內(nèi)感染的主要病原菌之一。在中國(guó)重癥監(jiān)護(hù)病房分離的革蘭陰性菌中，銅綠假單胞菌位列第一。由于具有天然和獲得性耐藥，銅綠假單胞菌對(duì)很多抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來(lái)很大困難。Β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類抗菌藥物是臨床治療Pae感染的常用藥，近年來(lái)隨著新的耐藥基因的不斷出現(xiàn)，Pae對(duì)這三類抗菌藥物的耐藥性普遍增加，甚至出現(xiàn)多藥耐藥（MDR）和泛耐藥（PDR）菌株。

2、>　　 因氨基糖苷類抗生素抗菌譜廣、療效卓越，在醫(yī)學(xué)臨床和畜牧獸醫(yī)業(yè)應(yīng)用廣泛,但由于濫用和過(guò)度使用氨基糖苷類藥物的耐藥問(wèn)題隨之凸現(xiàn)，細(xì)菌對(duì)該類藥物耐藥是因?yàn)榧?xì)菌產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶(AMEs)、16SrRNA甲基化酶和氨基糖苷類抗生素作用靶位16S rRNA基因突變而致。氨基糖苷類修飾酶按功能可分成乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）、磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH）、核苷轉(zhuǎn)移酶（ANT）三類，分別修飾氨基糖苷藥物相應(yīng)位置上的-OH和-NH2，降低或喪失其對(duì)靶位

3、核糖體的親和力。編碼AMEs的基因起源于抗生素產(chǎn)生菌，該類基因所表達(dá)的酶在抗生素產(chǎn)生菌中起到自我保護(hù)作用，許多研究表明抗藥性產(chǎn)生菌所存在的自我保護(hù)機(jī)制與臨床耐藥菌的耐藥機(jī)制相同。
　　 整合子是一個(gè)能夠通過(guò)自身編碼的整合酶來(lái)獲取保外游離基因或基因片段并使之表達(dá)的遺傳元件系統(tǒng)。整合子既可位于細(xì)菌染色體上,又可位于質(zhì)粒上,還可位于轉(zhuǎn)座子上。對(duì)細(xì)菌抗生素耐藥機(jī)制的研究，導(dǎo)致了包括轉(zhuǎn)座子和共軛質(zhì)粒在內(nèi)的許多移動(dòng)元件的發(fā)現(xiàn)，而通過(guò)對(duì)這些元

4、件序列進(jìn)行比較分析后，最終發(fā)現(xiàn)了整合子的存在。
　　 研究目的：
　　 銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染的主要條件致病菌之一，可引起嚴(yán)重的院內(nèi)獲得性感染。本研究試圖了解臨床常用的七種抗生素對(duì)60株銅綠假單胞菌（30株分離自門診病人，30株分離自住院病人）的抗菌活性和多黏菌素B與其它六種抗菌藥物(慶大霉素、奈替米星、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、亞胺培南)體外聯(lián)合抗菌效應(yīng)，以及各種抗菌藥物對(duì)不同標(biāo)本來(lái)源菌株的抗菌效應(yīng)有無(wú)差別；了解氨

5、基糖苷類耐藥相關(guān)基因和16SrRNA甲基化酶基因存在情況以及菌株之間的親緣性；另外通過(guò)對(duì)臨床分離的銅綠假單胞菌的耐藥特征進(jìn)行分析、檢測(cè)相關(guān)耐藥基因和整合子攜帶情況等，初步探討銅綠假單胞菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的分子耐藥機(jī)制，從而了解不同的耐藥機(jī)制間相互作用規(guī)律以及耐藥基因在菌株間水平傳播的特點(diǎn)，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和幫助。
　　 研究方法：
　　 1、藥敏試驗(yàn)和聯(lián)合藥敏試驗(yàn)
　　 60株銅綠假單胞菌均來(lái)自廣州醫(yī)學(xué)

6、院第一附屬醫(yī)院的臨床標(biāo)本，對(duì)這些菌株采用瓊脂稀釋法測(cè)定7種臨床常用抗生素的最低抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration,MIC）和藥敏情況，分析銅綠假單胞菌對(duì)這些抗生素的藥物敏感性；同時(shí)檢測(cè)多粘菌素B與其它6種藥物的聯(lián)合藥敏情況，分析它們之間的聯(lián)合藥敏情況，試圖開辟治療Pae感染新的途徑，在用藥選擇、降低用藥量和毒副作用方面起到一定作用。
　　 2、多藥耐藥銅綠假單胞菌氨基糖苷類修飾酶和16Sr

7、RNA甲基化酶基因分析
　　 針對(duì)臨床分離的Pae菌株，采用聚合酶鏈反應(yīng)分析氨基糖苷類修飾酶、16SrRNA甲基化酶基因型及其它基因型，運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)菌株樣本親緣性做聚類分析。
　　 3、整合子的鑒定與分析
　　 利用PCR方法，通過(guò)擴(kuò)增整合子恒定區(qū)的方法，篩選攜帶整合子的菌株，并利用限制性片段多態(tài)性性（RFLP）酶切分析的方法對(duì)這些整合子進(jìn)行分類；對(duì)整合子恒定區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性的菌株進(jìn)行測(cè)序和序列分析。探討

8、整合子攜帶的耐藥基因盒是否介導(dǎo)銅綠假單胞菌的多重耐藥。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、銅綠假單胞菌對(duì)三類六種抗生素耐藥率普遍較高，分別為奈替米星68.3％、妥布霉素65.0％、慶大霉素60.0％、環(huán)丙沙星46.7％、亞氨培南40.0％、阿米卡星13.3％，而多黏菌素B的耐藥率為0；這些菌株中多重耐藥和泛耐藥菌的檢出率分別為55.0％（33/60）和31.7％（19/60）。多黏菌素B與環(huán)丙沙星、亞氨培南有明顯聯(lián)合抗菌效應(yīng)，

9、多黏菌素B與奈替米星聯(lián)合，能明顯降低彼此的MICG。各種抗生素對(duì)住院病例分離菌株和門診病例分離菌株，在MICG和差異顯著性方面表現(xiàn)各不相同。
　　 2、21株氨基糖苷類耐藥菌株中（其中20株為多藥耐藥菌株），氨基糖苷類耐藥基因型aac(6,)-Ⅰ陽(yáng)性13株（61.9％）、aac(6,)-Ⅱ陽(yáng)性13株（61.9％）、ant(2,,)-Ⅰ陽(yáng)性10株（47.6％）、ant(3,,)-Ⅰ陽(yáng)性9株（42.9％）、aac(3)-Ⅱ陽(yáng)性的有1

10、株（4.8％），另有1株菌oprD2基因缺失，未檢出基因型aac(6,)-Ⅰae、aph(3,)-Ⅲ、aac(6,)-aph(2,,)和ant(4,)-Ⅰ；16SrRNA甲基化酶基因rmtA基因型陽(yáng)性19株（90.4％）、armA基因型陽(yáng)性有8株（38.1％），未檢出基因型rmtC、rmtD。聚類分析結(jié)果顯示分離的菌株中存在克隆傳播。
　　 3、30株臨床分離銅綠假單胞菌中16株（53.3％）整合子恒定區(qū)和可變區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性，片段長(zhǎng)

11、度在0.7-4kb之間。共檢出5種不同的整合子組合形式，含有編碼對(duì)氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類和喹喏酮類抗菌藥耐藥的基因,其中有2例為新型基因盒組合形式，包括aacA4-VIM2和aadA2-OXA10-aacA4-blaIMP9-aatI1，Genbank基因庫(kù)登陸號(hào)分別為GQ890658和GU122165，另外3例分別與Genbank基因庫(kù)登錄號(hào)為FJ917747、FJ817423、GU367339的序列吻合。
　　 4、I類整

12、合子3′-末端qacEΔ1-sul1和intI1類整合酶基因的陽(yáng)性率和陽(yáng)性菌株相同。
　　 結(jié)論：
　　 1、臨床檢出的銅綠假單胞菌對(duì)常用抗生素多表現(xiàn)為多重耐藥。多黏菌素B單用有很好的抗銅綠假單胞菌效果，與環(huán)丙沙星（喹諾酮類）、亞氨培南（β-內(nèi)酰胺類）聯(lián)合應(yīng)用也有明顯的聯(lián)合抗菌效應(yīng)。對(duì)多藥耐藥和泛耐藥菌株，為減少用藥量和毒副作用，提高抗菌效果，可考慮多黏菌素B與這些抗生素聯(lián)合用藥。
　　 2、大部分測(cè)試的銅綠假單

13、胞菌對(duì)臨床常用的銅綠假單胞菌抗感染藥物已產(chǎn)生廣泛耐藥，尤其對(duì)氨基糖苷類抗生素。這些菌株的氨基糖苷類修飾酶常見耐藥基因型檢出率高，16SrRNA甲基化酶基因型rmtA和armA的檢出率亦較高。30株測(cè)試菌株中存在克隆傳播。
　　 3、本研究中攜帶intI1類整合子的16株P(guān)ae對(duì)氨基糖苷類全部耐藥，對(duì)喹喏酮類耐藥的有13株，對(duì)亞氨培南耐藥的有10株，對(duì)所有三類抗生素全部耐藥的有8株占50％，說(shuō)明目前引起Pae耐藥的機(jī)制中，整合子耐