HIF-1α對糖尿病細(xì)胞表面黏附分子CD18和ICAM-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、研究背景:近年來越來越多的證據(jù)顯示，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy,DRP)早期是一種低度慢性炎癥。在這個炎癥過程中，白細(xì)胞和視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是最早期的關(guān)鍵事件。參與這個過程的白細(xì)胞，大多數(shù)是中性粒細(xì)胞。白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附依賴于細(xì)胞表面黏附分子CD18和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)的表達(dá)。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-i

2、nduciblefactor-1α，HIF-1α)是機體適應(yīng)氧損傷的最重要調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α也是一個重要的炎癥調(diào)節(jié)因子。在缺氧條件下，可以調(diào)控CD18和ICAM-1的表達(dá)，抑制缺氧引起的白細(xì)胞黏附。但是在早期DRP狀態(tài)下HIF-1α是否具有對CD18和ICAM-1的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。 目的：研究在早期DRP狀態(tài)下，HIF-1α對細(xì)胞表面CD18和ICAM-1表達(dá)以及白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響，探討將HIF-1α

3、作為早期DRP藥物治療靶點的可行性。 方法：(1)收集不同階段DRP病例和健康對照者。用流式細(xì)胞儀檢查受試者外周血中性粒細(xì)胞表面CD18的表達(dá)。并通過廣義線性模型和多元線性回歸分析CD18的平均熒光強度(meanchannelfluorescence，MCF)和DRP臨床分期及各項生化指標(biāo)的關(guān)系；(2)收集上述受試者血清及外周血中性粒細(xì)胞，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbantassay，ELIS

4、A)和Real-timePCR分別檢測血清中ICAM-1的濃度和中性粒細(xì)胞CD18mRNA水平。通過免疫組織化學(xué)和Westernblot檢測中性粒細(xì)胞HIF-1α蛋白水平。研究HIF-1α蛋白與前兩者的Spearman相關(guān)系數(shù)；(3)體外培養(yǎng)人粒細(xì)胞系白血病細(xì)胞HL60和恒河猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞系細(xì)胞RF/6A。以上述受試者血清為刺激因素，瞬時轉(zhuǎn)染HIF-1α反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASODN)

5、和正義寡核苷酸(senseoligonucleotides，SODN)，通過免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot檢測兩種細(xì)胞HIF-1α蛋白水平。以流式細(xì)胞儀、Real-timePCR和ELISA方法分別檢測CD18蛋白、CD18mRNA和ICAM-1的表達(dá)水平，以虎紅染色法研究兩種細(xì)胞的黏附率；(4)誘導(dǎo)糖尿病動物模型，體內(nèi)轉(zhuǎn)染HIF-1αASODN和SODN，免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot檢測外周血中性粒細(xì)胞和視網(wǎng)膜HIF-1

6、α蛋白水平。分別以流式細(xì)胞儀和丫啶橙白細(xì)胞造影觀察外周血中性粒細(xì)胞CDl8水平及視網(wǎng)膜白細(xì)胞黏附量，研究HIF-1α蛋白水平和這兩項指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果：(1)廣義線性模型分析顯示，CD18MCF和DRP分期之間存在線性關(guān)系(P＜0.001)。調(diào)整了混雜因素的影響之后，這種線性關(guān)系仍有顯著意義(P＜0.001)。DRP程度越重，CD18MCF水平越高(趨勢檢驗，P值分別是0.00，0.02和0.04)。(2)正常對照組血清中sICAM-1水

7、平是32.05±4.83ng/ml。DRP各組(包括DRP1期組、DRP2-4期組和DRP5期組)血清中sICAM-1水平均顯著高于正常對照組(Dunnet-t檢驗，P值分別為0.047，0.010，0.017)。隨著DRP進(jìn)展，sICAM-1水平逐漸升高(趨勢檢驗，P＜0.001)。中性粒細(xì)胞CD18mRNA水平在DRP-1期是正常對照組的4.75±0.25倍，DRP-2～4期是6.77±0.25倍，DRP-5期是9.38±1.02倍

8、(F=128.56，P＜0.001)。其水平隨DRP的進(jìn)展而顯著升高(趨勢檢驗，P=0.002)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞HIF-1α蛋白在正常對照組有微弱表達(dá)，隨DRP加重程度逐漸加深。經(jīng)Westernblot分析HIF-1α蛋白平均表達(dá)水平在正常對照組為0.12±0.03；各DRP組水平高于正常對照組，并且隨著DRP進(jìn)展水平升高(趨勢檢驗，P=0.001)。相關(guān)分析顯示，中性粒細(xì)胞HIF-1α蛋白平均表達(dá)水平和血清sIC

9、AM-1及中性粒細(xì)胞CD18mRNA水平顯著正相關(guān)。Spearman相關(guān)系數(shù)分別是0.81和0.64(P＜0.05)。(3)HIF-1αASODN能被梭華-SofastTM基因轉(zhuǎn)染試劑成功轉(zhuǎn)入HL60細(xì)胞和RF/6A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率分別為75.1±3.4％和80.3±4.5％。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，正常血清培養(yǎng)條件下HL60細(xì)胞少量表達(dá)HIF-1α蛋白，糖尿病血清刺激后蛋白表達(dá)增多，HIF-1αASODN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)陽性染色減弱。經(jīng)West

10、ernblot分析，HIF-1α蛋白平均表達(dá)水平在正常血清培養(yǎng)組為0.19±0.04；DRP血清刺激之后，HIF-1α蛋白平均表達(dá)水平顯著上調(diào)，HIF-1αASODN轉(zhuǎn)染抑制這種上調(diào)作用。各組之間表達(dá)水平有顯著差異(F=75.03，P＜0.001)。和正常對照組相比，DRP血清培養(yǎng)明顯提高HL60細(xì)胞CD18陽性細(xì)胞比例(42.23±2.60.vs.17.06±6.01)，HIF-1αASODN轉(zhuǎn)染后CD18陽性比例下降(25.33±3

11、.05.vs.42.23±2.60)。糖尿病血清刺激可顯著提高CD18mRNA水平，達(dá)到正常對照組的21.05±2.07倍，HIF-1αASODN轉(zhuǎn)染抑制了這種上調(diào)作用(F=180.34，P＜0.001)。免疫組織化學(xué)顯示在正常人血清培養(yǎng)條件下，RF/6A細(xì)胞內(nèi)即有少數(shù)HIF-1α陽性染色細(xì)胞出現(xiàn)。DRP血清刺激組陽性染色細(xì)胞增多，HIF-1αASODN轉(zhuǎn)染組陽性細(xì)胞數(shù)量較單純DRP血清培養(yǎng)組減少。HIF-1αSODN轉(zhuǎn)染組陽性細(xì)胞數(shù)量

12、與單純DRP血清刺激組相似。經(jīng)Westernblot分析，四組的HIF-1α蛋白平均表達(dá)水平分別為0.09±0.02，0.43±0.09，0.24±0.06和0.51±0.08。DRP血清上調(diào)了細(xì)胞上清中sICAM-1的水平(13.89±1.35vs.25.26±1.97)。HIF-1αASODN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清中sICAM-1的水平顯著下降(F=81.89，P＜0.001)。DRP血清培養(yǎng)促進(jìn)HL60細(xì)胞和RF/6A細(xì)胞的黏附，抑制HI

13、F-1α表達(dá)后，黏附水平下降(F=13.06，P=0.002)。(4)Westernblot的結(jié)果顯示，糖尿病較非糖尿病動物外周血中性粒細(xì)胞HIF-1α蛋白水平顯著提高(0.17±0.06vs.0.60±0.10)；HIF-1αASODN轉(zhuǎn)染后較糖尿病組下降約50％(0.30±0.10vs.0.60±0.10)。各組之間HIF-1α表達(dá)水平有顯著差異(F=28.92，P＜0.001)。正常對照組視網(wǎng)膜HIF-1α少量微弱表達(dá)，在糖尿病誘

14、導(dǎo)成功后表達(dá)水平明顯上升。而HIF-1僅ASODN轉(zhuǎn)染組明顯下降，HIF-1αSODN轉(zhuǎn)染對HIF-1α無顯著影響。Westernblot的分析結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜HIF-1α蛋白平均表達(dá)水平分別為0.10±0.02，0.36±0.02，0.15±0.10和0.29±0.01(F=96.48，P＜0.001)。糖尿病動物外周血中性粒細(xì)胞CD18的陽性細(xì)胞比例是正常對照組的1.4倍(18.66±1.52vs.44.93±3.60)。抑制HIF

15、-1α蛋白表達(dá)后，陽性細(xì)胞比例下降至31.66±4.72(F=42.46，P=0.00)。丫啶橙視網(wǎng)膜白細(xì)胞染色結(jié)果顯示正常對照組陽性染色細(xì)胞為46.16±10.68。糖尿病兩個月后陽性細(xì)胞數(shù)較正常對照組提高約1.89倍。HIF-1αASODN轉(zhuǎn)染可以降低視網(wǎng)膜白細(xì)胞數(shù)量25％，HIF-1αSODN轉(zhuǎn)染對視網(wǎng)膜白細(xì)胞浸潤沒有顯著影響(133.83±20.43vs.121.33±10.23，P=0.12)。 結(jié)論：(1)DRP患者

16、外周血中性粒細(xì)胞表面CD18水平較正常人顯著提高，DRP分期和CD18水平之間存在顯著正相關(guān)性；外周血中性粒細(xì)胞表面CD18水平可能作為DRP程度的一種標(biāo)志；(2)DRP患者處于一定程度的炎癥狀態(tài)中。隨著DRP的進(jìn)展，炎癥及血管內(nèi)皮細(xì)胞損害逐漸加重。同時，外周血中性粒細(xì)胞CD18轉(zhuǎn)錄增強，這種增強和細(xì)胞中HIF-1α蛋白水平之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系；(3)在體外培養(yǎng)條件下，糖尿病血清能誘導(dǎo)HL60細(xì)胞表達(dá)HIF-1α、CD18蛋白及CD1

17、8mRNA。同時能夠上調(diào)RF/6A細(xì)胞表達(dá)ICAM-1，促進(jìn)HL60細(xì)胞和RF/6A細(xì)胞的黏附。HIF-1α對糖尿病血清培養(yǎng)條件下的HL60細(xì)胞和RF/6A細(xì)胞表達(dá)CD18和ICAM-1，以及兩種細(xì)胞之間的黏附都有調(diào)節(jié)作用；(4)糖尿病動物外周血中性粒細(xì)胞表達(dá)CD18，HIF-1α，及視網(wǎng)膜組織HIF-1α蛋白表達(dá)增多，其視網(wǎng)膜組織白細(xì)胞浸潤數(shù)量增加。在體內(nèi)試驗條件下，HIF-1α蛋白能夠下調(diào)糖尿病動物外周血中性粒細(xì)胞表達(dá)CD18及視網(wǎng)