SRB1、ITGB2基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究.pdf

1、背景:
　　冠心病是一種由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，是世界范圍內(nèi)死亡和致殘的首要原因之一。脂代謝異常和炎癥是冠心病發(fā)生、發(fā)展的兩大機(jī)制，也是近年來(lái)冠心病研究的熱點(diǎn)。B類1型清道夫受體(scavenger receptor class B type1，SRB1)是最主要的高密度脂蛋白(HDL)受體，既能介導(dǎo)肝臟對(duì)高密度脂蛋白中膽固醇脂的選擇性攝取，又能促進(jìn)外周組織細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至HDL，從而保持膽固醇代謝的平衡

2、并防止游離膽固醇在動(dòng)脈壁中堆積。SRB1的缺失可導(dǎo)致動(dòng)脈壁內(nèi)膽固醇平衡紊亂以及脂質(zhì)在動(dòng)脈壁大量沉積和動(dòng)脈硬化癥的發(fā)生。炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病發(fā)病的另一重要機(jī)制，炎癥反應(yīng)中白細(xì)胞的粘附、趨化等過(guò)程的基礎(chǔ)是細(xì)胞黏附和黏附分子的作用。整合素β2（ITGB2，integrin beta2），即CD18，是黏附分子中整合素家族的重要成員。在前期的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，我們發(fā)現(xiàn)，冠心病患者心外膜脂肪組織中ITGB2在表達(dá)水平較非冠心病患者明顯上調(diào)

3、（1.6倍），而在相應(yīng)的皮下脂肪組織中的表達(dá)水平確明顯下調(diào)（0.1倍）。提示ITGB2可能通過(guò)參與炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附、炎癥細(xì)胞趨化等過(guò)程，從而在動(dòng)脈粥樣硬化形成的起始階段發(fā)揮作用。冠心病是一種復(fù)雜的多基因遺傳病，從遺傳學(xué)的角度研究冠心病的發(fā)病機(jī)制，可能為冠心病提供一種新的診療手段。
　　目的:
　　本研究的目的在于，對(duì)中國(guó)北方漢族人群SRB1和ITGB2基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行分析，探討這兩個(gè)基因SNPs

4、位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率與冠心病發(fā)病的相關(guān)性;同時(shí)探索SNPs位點(diǎn)與研究對(duì)象的糖、脂代謝指標(biāo)的相關(guān)性。為闡明冠心病的遺傳機(jī)制、評(píng)估冠心病的病變程度和預(yù)后提供新的指標(biāo)。
　　方法:
　　1、研究對(duì)象
　　研究對(duì)象來(lái)自北京協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科冠心病研究數(shù)據(jù)庫(kù)，所有研究對(duì)象均于我院行冠狀動(dòng)脈造影檢查，并進(jìn)行了詳細(xì)的病史采集和血生化指標(biāo)收集。根據(jù)我院冠狀動(dòng)脈造影檢查結(jié)果進(jìn)行診斷，左主干、右冠、左前降支、左回旋支中有一支以上狹窄

5、≥50％診斷為冠心病。根據(jù)冠脈造影結(jié)果進(jìn)行分組，冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果證實(shí)本研究入選以上血管狹窄≥75％患者為冠心病組，冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果未見異?；颡M窄＜25％作為非冠心病組。從冠心病研究數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出性別、年齡、BMI、糖尿病患者比例、血脂異常患者比例能夠匹配的患者作為研究對(duì)象。
　　2、篩選SNPs位點(diǎn)
　　(1)在haploview中挑選基因的標(biāo)簽SNP，選擇其中位于基因功能區(qū)（如啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)、3' UTR或5'UTR）

6、的SNPs位點(diǎn)，之后在Hapmap中查找目標(biāo)SNP在中國(guó)人群中的MAF值（最小等位基因頻率），以MAF大于0.05為原則;
　　(2)依據(jù)全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)結(jié)果及國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，篩選曾經(jīng)報(bào)道過(guò)陽(yáng)性結(jié)果或趨勢(shì)的SNPs位點(diǎn)。
　　3、SNP檢測(cè)方法
　　使用OMEGA公司提供的全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)檢，之后利用Sequenom MassARRAY SNP檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行

7、檢測(cè)。檢測(cè)過(guò)程主要包括引物設(shè)計(jì)及合成、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、SAP純化反應(yīng)、單堿基延伸反應(yīng)、質(zhì)譜檢測(cè)（基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）分析，檢測(cè)結(jié)果使用TYPER4.0軟件(sequenom)分型并輸出結(jié)果。
　　4、統(tǒng)計(jì)分析方法
　　基因型頻率分布的Hardy.Weinberg平衡(HWE)檢驗(yàn)、最小等位基因頻率(Minorallele frequency，MAF)、“病例-對(duì)照”關(guān)聯(lián)研究數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Plink軟件;不同基因

8、型間計(jì)量數(shù)據(jù)的比較應(yīng)用SPSS17.0，其中連續(xù)變量使用單因素方差分析，分類變量使用卡方分析;單體型分析應(yīng)用Haploview4.0軟件，P＜0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　1、一般臨床資料
　　冠心病組496例，其中男性256人，女性244人，平均年齡為60.19±9.8歲。正常對(duì)照組367例，其中男性181人，女性186人，平均年齡為59.39±11.00歲。兩組之間性別、年齡、BMI、糖尿病患者

9、比例、血脂異?；颊弑壤裏o(wú)顯著性差異。
　　2、Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)
　　SRB1基因的三個(gè)SNP位點(diǎn)rs838880、rs5888、rs5889和ITGB2基因的三個(gè)SNP位點(diǎn)rs235326、rs2070947、rs2070946均符合Hardy-Weinberg平衡，樣本具有較好的代表性。
　　3、SNPs位點(diǎn)的“病例-對(duì)照”關(guān)聯(lián)分析
　　分別對(duì)SRB1基因的三個(gè)SNP位點(diǎn)rs838880、r

10、s5888、rs5889和ITGB2基因的三個(gè)SNP位點(diǎn)rs235326、rs2070947、rs2070946的等位基因頻率、基因型頻率在冠心病組和非冠心病組進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，并通過(guò)基因模型模擬進(jìn)行分析。SRB1基因rs838880位點(diǎn)(C/T)等位基因頻率和基因型頻率在兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異，P值分別為0.017、0.0028。通過(guò)基因模型模擬，當(dāng)?shù)任换駽為隱性遺傳時(shí)，即基因型為CC型時(shí)，與另外兩種基因型(CT型+TT型)相比，兩

11、組之間的基因型頻率統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異，P值為0.000672。在冠心病組與非冠心病組間SNPs位點(diǎn)隱性模型的關(guān)聯(lián)分析中，ITGB2基因的rs2070947位點(diǎn)(GG vs CA+AA)在兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(p=0.03），基因型為GG型的人群冠心病的發(fā)生率為73％，而基因型為GA或AA時(shí)，冠心病的發(fā)生率為56％。
　　4、不同基因型間計(jì)量和計(jì)數(shù)資料的比較
　　對(duì)上述SNPs位點(diǎn)三個(gè)基因型間臨床及血清代謝指標(biāo)進(jìn)行比較，S

12、RB1基因rs5888位點(diǎn)三個(gè)基因型（AA型、AG型、GG型）間，血脂異常病史、LPA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均為0.03），三種基因型中，AA型有高脂血癥病史的人數(shù)明顯少于另外兩種基因型，AA型LPA水平明顯低于另外兩種基因型。ITGB2基因rs235236位點(diǎn)三個(gè)基因型（AA型、AG型、GG型）間，高血壓病史、HDL、APOA1統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異，AA型HDL水平高于另外兩種基因型，AG型APOA1水平低于另外兩種基因型。ITGB2基

13、因rs2070947位點(diǎn)三個(gè)基因型（GG型、GA型、AA型）間，TG統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P=0.01)，GA型TG水平明顯高于另外兩組。rs2070946位點(diǎn)三個(gè)基因型（CC型、CT型、TT型）間，APOA1、hsCRP統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P值分別為0.01、0.02)。CT型APOA1及hsCRP的水平均明顯高于另外兩個(gè)基因型的人群。
　　結(jié)論:
　　SRB1基因的rs838880位點(diǎn)(C/T)與冠心病的發(fā)生有相關(guān)性，基因

14、型為CC型的人群相對(duì)于具有其他兩種基因型的人群，其冠心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯降低，C等位基因可能對(duì)冠心病的發(fā)病起保護(hù)作用。SRB1基因rs5888位點(diǎn)與脂質(zhì)代謝有關(guān)，A等位基因可能對(duì)脂代謝異常起保護(hù)作用。ITGB2基因的rs2070947位點(diǎn)，基因型為GG型的人群冠心病的發(fā)生率為(73％)明顯高于基因型為GA或AA型(56％)，GG基因型可能是冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)因素。ITGB2基因rs2070946位點(diǎn)基因型為CT型的人群hsCRP水平升高，C