小檗堿對(duì)心肌肥厚及纖維化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 心肌肥厚與纖維化是心臟長(zhǎng)期負(fù)荷過重時(shí)發(fā)生的一種心室重構(gòu)，除心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加和細(xì)胞體積增大外，還伴隨心肌細(xì)胞間結(jié)締組織沉積。心肌肥厚也是多種心血管系統(tǒng)疾病的常見并發(fā)癥和病理基礎(chǔ)，常導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常、心力衰竭，預(yù)防與逆轉(zhuǎn)這種改變是治療的重要目標(biāo)。
　　 磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種在細(xì)胞內(nèi)行使能量代謝調(diào)節(jié)的蛋白激酶。目前對(duì)A

2、MPK的研究主要集中在能量代謝調(diào)節(jié)方面，且在糖尿病及肥胖癥等人類代謝性疾病的發(fā)病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AMPK基因突變可導(dǎo)致心肌肥大及心律失常，以及AMPK的激活可通過負(fù)性調(diào)節(jié)mTOR/ p70S6K通路減輕由壓力負(fù)荷過度誘發(fā)的的心肌肥厚與纖維化。因此AMPK有望成為心肌肥厚與纖維化疾病中的治療新靶點(diǎn)。
　　 小檗堿（Berberine，BBR），一種天然異喹啉類生物堿，作為清熱解毒藥和抗菌藥應(yīng)用于臨床已有很長(zhǎng)

3、的歷史。隨著對(duì)小檗堿的深入研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿在糖尿病、代謝性疾病、心血管疾病中具有廣泛的藥理作用，表現(xiàn)為抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗Ⅱ型糖尿病、對(duì)抗肥胖癥、對(duì)心臟的正向肌力作用、抗心律失常、擴(kuò)張血管降壓、抗心肌缺血等。大量的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，其主要是通過激活A(yù)MPK而起作用。鑒于AMPK在心肌肥厚及纖維化中的作用，我們推測(cè)小檗堿可能通過激活A(yù)MPK抑制心肌肥厚及纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　 在心臟中，AMPKα2是其主要的催化亞基，我們應(yīng)用AMPK

4、α2基因敲除小鼠，擬在壓力負(fù)荷過度誘發(fā)的的小鼠心肌肥厚與纖維化模型基礎(chǔ)上，研究Berberine對(duì)心肌肥厚與纖維化的作用，同時(shí)進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，闡明小檗堿對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚及纖維化的作用、作用靶點(diǎn)及相關(guān)分子機(jī)制。希望能為小檗堿治療心肌肥厚及纖維化提供科學(xué)的理論依據(jù)，同時(shí)為心肌肥厚與纖維化疾病的治療提供新的治療靶點(diǎn)。
　　 目的：
　　 獲得Berberine抑制心肌肥厚及纖維化的可靠證據(jù)，并闡明其作用機(jī)制，

5、為AMPK作為心肌肥厚及纖維化治療的新靶點(diǎn)提供充分的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為Berberine作為心肌肥厚及纖維化治療提供充分的理論研究。
　　 方法：
　　 1Berberine對(duì)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大作用的研究
　　 培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞，用不同濃度（0, 5, 10, 20, 30mM）Berberine預(yù)處理心肌細(xì)胞60min后，用100mM PE（phenylephrine，苯腎上腺素）處理心肌細(xì)胞0, 6,

6、12, 24,48h。采用[3H]-亮氨酸摻入法、計(jì)算心肌細(xì)胞面積、real-time PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物心房鈉尿肽（AtriAlnatriuretic peptide， ANP）、B型利鈉肽(B-type natriuretic peptide，BNP)，評(píng)價(jià)各組心肌細(xì)胞肥大的情況，篩選最佳的用藥劑量濃度及作用時(shí)間。
　　 2 Berberine對(duì)AB誘導(dǎo)的野生型小鼠心肌肥厚及纖維化作用的研究
　　 選取8周

7、齡、體重24-26g雄性C57BL/6野生型小鼠，以胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚模型。實(shí)驗(yàn)共分八組：Sham(假手術(shù))組、AB(Aortic binding，主動(dòng)脈縮窄術(shù))模型組、Sham組+BBR（berberine）低中高劑量（40mg/kg、80mg/kg、100mg/kg）組、AB模型組+BBR低中高劑量（40mg/kg、80mg/kg、100mg/kg）組，每組各20只。術(shù)后8w，超聲及血流動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)小鼠心臟功能；HE染色觀察

8、心臟大體組織和細(xì)胞橫切面積；PSR（Picrosirius red，天狼星紅染色）觀察心肌組織膠原；real-time PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP、BNP、肌球蛋白重鏈α(α-myosin heavy chain, α-MHC)、肌球蛋白重鏈β(β-myosin heavy chain, β-MHC），心肌纖維化標(biāo)志物結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（Connective tissue growth factor， CTGF）、I型溶膠原α1(

9、Procollagen, type I，α1, CollagenI)、III型溶膠原α1(Procollagen, type III, α1, CollagenIII）的mRNA水平，評(píng)價(jià)Berberine對(duì)胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚的作用，篩選藥物的最佳作用劑量。
　　 3 Berberine抑制心肌肥厚及纖維化分子機(jī)制的探討
　　 30mMBerberine預(yù)處理大鼠原代心肌細(xì)胞60min，用100mM PE處理心

10、肌細(xì)胞0,48h。8周齡、體重24-26g雄性C57BL/6野生型小鼠，以胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚模型；實(shí)驗(yàn)分四組：Sham(假手術(shù))組、AB模型組、Sham組+BBR（berberine）（100mg/kg）組、AB模型組+BBR低（100mg/kg）組，每組各20只。Wetern blot 檢測(cè)AMPK相關(guān)信號(hào)通路總蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)水平。
　　 4 Berberine對(duì)AB誘導(dǎo)的AMPKα2 Ko小鼠心肌肥厚及纖維

11、化作用的研究
　　 選取8周齡、體重24-26g雄性AMPKα2 Ko（knock out）小鼠，以胸主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚模型。實(shí)驗(yàn)共分四組：Sham(假手術(shù))組、AB模型組、Sham組+BBR（100mg/kg）組、AB模型組+BB（100mg/kg）組，每組各20只。術(shù)后4w，超聲及血流動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)小鼠心臟功能；HE染色觀察心臟大體組織和細(xì)胞橫切面積；PSR觀察心肌組織膠原；real-time PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志

12、物ANP、BNP、α-MHC、β-MHC、膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1（acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 1, Acat1）、血管緊張素Ⅱ受體1亞型(angiotensin 2 receptor, type 1, AT1)、GATA結(jié)合蛋白4(GATA binding protein 4, GATA4)、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C (myocyte enhancer factor 2C， Mef2c)、鈣神經(jīng)素1調(diào)節(jié)

13、劑(regulator of calcineurin 1, MCIP1.4、肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a (sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase， SERCA2a)、血管緊張素1轉(zhuǎn)換酶(angiotensin I converting enzyme， ACE）以及纖維化標(biāo)志物轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(transforming gr

14、owth factor β2, TGFβ2)、Collagen I、Collagen Ⅲ、CTGF、纖維連接素(Fibronection, FN)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metallopeptidase2, MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetallopeptidase9, MMP-9)、骨橋蛋白(osteopontin， OPN)。
　　 結(jié)果：
　　 1Berberine對(duì)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)

15、胞肥大作用的探討
　　 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Berberine能夠減少PE誘導(dǎo)后的原代大鼠心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入量的增多、心肌細(xì)胞面積的增大、心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP、BNP的升高，且成劑量依賴性，30mM時(shí)作用最為明顯。表明Berberine能夠抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。
　　 2 Berberine對(duì)AB誘導(dǎo)的野生型小鼠心肌肥厚及纖維化作用的影響
　　 超聲及血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，模型組中，左室舒張末期內(nèi)

16、徑（Left ventricμlar end-diastolic dimension， LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricμlar end-systolic dimension， LVESD)、左室后壁厚度(Left ventricμlus posterior wall dimension， LVPWd顯著升高（P<0.05），而短軸縮短率(FractionAlshortening， FS)顯著下降（P<0.05）

17、，給予Berberine治療后LVEDD、LVESD、LVPWd顯著降低（P<0.05），而FS顯著升高（P<0.05），其中高劑量組（100mg/kg）組最為顯著；病理染色結(jié)果顯示：模型組中，心肌細(xì)胞面積顯著增大（p<0.05）、心肌組織膠原明顯增多（p<0.05），給予Berberine治療后，心肌細(xì)胞面積顯著減?。╬<0.05）、心肌組織膠原明顯增少（p<0.05）；real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組中心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志

18、物（ANP、BNP、α-MHC、β-MHC）、心肌纖維化標(biāo)志物（CTGF、CollagenI、CollagenIII）的mRNA水平明顯上升，給予Berberine治療后，心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物（ANP、BNP、β-MHC）、心肌纖維化標(biāo)志物（CTGF、CollagenI、CollagenIII）的mRNA水平明顯下降。表明berberine能顯著抑制由胸主動(dòng)脈誘導(dǎo)的心肌肥厚。
　　 3 Berberine抑制心肌肥厚及纖維化的分子

19、機(jī)制
　　 Western blot 檢測(cè)結(jié)果表明，在PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大模型中及主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型中，AMPK、ACC、mTOR、p70S6K及eEF2的總蛋白無變化，而它們的磷酸化水平p-AMPK、p-ACC ser79、p-mTOR、p-p70S6Kthr389顯著上調(diào)（P<0.05），p-eEF2thr56顯著下調(diào)（P<0.05），表明在PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大模型中及主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模

20、型中，AMPK及mTOR/70S6K信號(hào)通路被激活；應(yīng)用Berberine干預(yù)后，與模型組相比較，AMPK、ACC、mTOR、70S6K及eEF2的總蛋白無變化，磷酸化水平p-AMPK、p-ACCser79、p-eEF2 thr56顯著上調(diào)（P<0.05），而p-mTOR、p-70S6K thr389顯著下調(diào)（P<0.05），表明Berberine可進(jìn)一步激活A(yù)MPK，負(fù)性調(diào)節(jié)mTOR/70S6K信號(hào)通路。
　　 4 Berbe

21、rine對(duì)AB誘導(dǎo)的AMPKα2 Ko小鼠心肌肥厚及纖維化作用
　　 超聲及血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，模型組中， LVEDD、LVESD、LVPWd顯著升高（P<0.05），而FS顯著下降（P<0.05），給予Berberine干預(yù)后LVEDD、LVESD、LVPWd、 FS無顯著變化（P>0.05）；病理染色結(jié)果顯示：模型組中，心肌細(xì)胞面積顯著增大（p<0.05）、心肌組織膠原明顯增多（p<0.05）；給予Berberine干預(yù)后，

22、心肌細(xì)胞面積、心肌組織膠原無顯著改變（P>0.05）；real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組中心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物（ANP、BNP、β-MHC、Acat1、Mcip1.4、ACE、GATA4、Mef2c）的mRNA水平顯著升高（p<0.05），AT1、SERCA2a顯著降低（p<0.05），以及纖維化指標(biāo)（TGFβ1、TGFβ2、Collagen I、Collagen Ⅲ、CTGF、Fibronection、MMP-2、MMP-9