近江牡蠣糖胺聚糖免疫調(diào)節(jié)作用及體外抗腫瘤活性的研究.pdf

1、目的：
　　本文以近江牡蠣全臟器為實(shí)驗(yàn)原料，通過酶解法提取近江牡蠣糖胺聚糖(Crassostrea Rivularis glycosaminoglycan)，對其理化性質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)作用、體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究。
　　方法：
　　采用柱層析法分離純化近江牡蠣糖胺聚糖得到純化級分；用高效液相色譜(HPLC)法、紅外光譜(IR)法分析其理化性質(zhì)；采用小鼠體內(nèi)注射環(huán)磷酰胺(CTX)法建立免疫抑制動(dòng)物模型以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，分析近江牡

2、蠣糖胺聚糖對小鼠的非特異性免疫、細(xì)胞免疫、體液免疫和NK細(xì)胞活性的影響；采用ELISA法檢測腫瘤壞死因子TNF-α、干擾素IFN-γ，、小鼠白細(xì)胞介素IL-2的含量；同時(shí)測定近江牡蠣糖胺聚糖體外對K562、CNE-2Z、Hela細(xì)胞生長的影響。
　　結(jié)果：
　　1.對酶解法提取得到的近江牡蠣糖胺聚糖粗提物(PCG)進(jìn)行等電點(diǎn)除蛋白和超濾脫鹽濃縮，得到精制品(CG)，經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離得到組分CGⅠ和CGⅡ。對CGⅠ

3、和CGⅡ分別過Sephadex G-200凝膠柱，得到組分CGⅠa和CGⅡa。經(jīng)分析，CGⅠa是由糖醛酸：氨基葡萄糖=1:1.38的比例構(gòu)成，硫酸基含量為20.62％，相對分子量5.17×105Da；CGⅡa，是由糖醛酸：氨基葡萄糖=1:1.58的比例構(gòu)成，硫酸基含量為18.49％，相對分子量為2.64×105Da。紅外光譜分析顯示，CGⅠa和CGⅡa都具有糖胺聚糖的特征吸收，CGⅡa具有α糖苷鍵。
　　2.近江牡蠣糖胺聚糖對免疫

4、功能的調(diào)節(jié)作用結(jié)果：
　　(1)對小鼠免疫器官的影響：在體外免疫抑制模型中，50 mg/kg和100 mg/kg的CG可以顯著增強(qiáng)正常小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)(P<0.05，P<0.01)；并對CTX造成的免疫抑制小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)具有修復(fù)作用，效果顯著(P<0.05，P<0.01)。
　　(2)對小鼠細(xì)胞免疫的影響：CG，CGⅠa，CGⅡa(10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)均能促進(jìn)和協(xié)同

5、ConA促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增值，其中25μg/ml的CGⅠa劑量組的刺激系數(shù)最高，達(dá)到1.44。CG、CGⅠa和CGⅡa協(xié)同ConA刺激脾淋巴細(xì)胞的增值效果體現(xiàn)出了與CG、CGⅠa、CGⅡa直接作用于脾淋巴細(xì)胞的增持效果相同的趨勢，其相關(guān)性較強(qiáng)。
　　(3)對小鼠單核巨噬細(xì)胞的影響：CGⅠa和CGⅡa(10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)均能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力(P<0.05或P<0

6、.01)；25mg/kg和50 mg/kg劑量的CG對小鼠廓清指數(shù)有顯著增強(qiáng)作用(P<0.05)。
　　(4)對小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)和血清溶血素的影響：CG(25 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg)抗體生成數(shù)與生理鹽水對照組均有極顯著差異(P<0.01)，對CTX模型組的治療效果極其顯著(P<0.001)；CG(50 mg/kg，100mg/kg)的小鼠血清溶血素含量與生理鹽水對照組有極顯著差異(P<0.01)，CG

7、(25 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg)能夠提高CTX模型組的血清溶血素水平(P<0.05或P<0.01)。
　　(5)對NK細(xì)胞的影響：CG、CGⅠa、CGⅡa的四個(gè)劑量組(10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)均能增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性(P<0.05或P<0.01)，存在一定的量效關(guān)系。100μg/mL的CGⅠa殺傷活性最高，達(dá)到39.09％。
　　(6)細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果：C

8、GⅠa和CGⅡa(251μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)均能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α和NO(P<0.05或P<0.01)；CGⅠa和CGⅡa(25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)能夠促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2(P<0.05或P<0.01)和IFN-γ(P<0.01)；TNF-α、IFN-γ、IL-2的最大產(chǎn)生量分別為912.941 pg/mg，651.579 pg/m

9、g，2.821pg/mg。
　　3.體外腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)：CG，CGⅠa和CGⅡa(10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL)對K562、CNE-2Z、Hela細(xì)胞的生長均具有抑制作用，與5-Fu合用可以增敏抗腫瘤藥效。
　　結(jié)論：
　　(1)近江牡蠣糖胺聚糖的純化級分CGⅠa和CGⅡa的相對分子量分別為5.17×105Da和2.64×105Da，經(jīng)化學(xué)法分析和紅外光譜分析都是糖胺

10、聚糖。
　　(2)近江牡蠣糖胺聚糖對正常小鼠免疫器官指數(shù)、細(xì)胞免疫的影響、單核巨噬細(xì)胞影響、抗體生成數(shù)和血清溶血素影響、NK細(xì)胞的殺傷活性均為陽性，表明其具有免疫增強(qiáng)功能。免疫功能的增強(qiáng)可能是通過促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌實(shí)現(xiàn)的。
　　(3)近江牡蠣糖胺聚糖在體外直接作用于腫瘤細(xì)胞K562、CNE-2Z和Hela，一定程度地抑制其生長，并能夠與5-Fu聯(lián)用來增強(qiáng)抑制腫瘤細(xì)胞生長的效果；根據(jù)近江牡蠣糖胺聚糖對體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的作用結(jié)果