轉(zhuǎn)豬PGC-1α基因小鼠的制備.pdf

1、肌纖維類型是影響豬肉品質(zhì)的重要因素，但是通過傳統(tǒng)的雜交育種方法來改變豬肌纖維的類型時間過長。然而轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，提供了一種快速改變動物遺傳信息并獲得新表型的方法，成為育種的新方法。本研究選擇豬PGC-1α這一與肌纖維轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因用于制備表達(dá)PGC-1α的轉(zhuǎn)基因小鼠，為轉(zhuǎn)基因豬的制備提供理論依據(jù)。
　　 首先，利用NCBI查詢豬PGC-1α基因的mRNA序列，在起始密碼子前添加SalⅠ酶切位點(diǎn)，在終止密碼子后添加NotⅠ酶切位

2、點(diǎn)，然后合成cDNA序列，并將其克隆進(jìn)pCAGGS-neo真核表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染小鼠的C2C12細(xì)胞，通過RT-PCR能夠檢測到PGC-1α在小鼠C2C12細(xì)胞中得到廣泛表達(dá)。
　　 利用合成的PGC-1α全長cDNA序列構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體pCAGGS-PGC-1α-neo，用于轉(zhuǎn)基因小鼠的制備。通過顯微注射的方法制備pCAGGS-PGC-1α-neo轉(zhuǎn)基因小鼠，PCR檢測證實(shí)22只pCAGGS-PGC-1α-neo轉(zhuǎn)

3、基因小鼠的基因組中整合有轉(zhuǎn)入基因，轉(zhuǎn)基因陽性率為29.73%，選取founder鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配傳代，建立相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠系。對轉(zhuǎn)基因小鼠系中外源性PGC-1α表達(dá)進(jìn)行鑒定，首先提取轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉組織的總RNA，進(jìn)行了RT-PCR的檢測，結(jié)果表明pCAGGS-PGC-1α-neo轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉組織中有PGC-1α的轉(zhuǎn)錄。然后分別提取pCAGGS-PGC-1α-neo轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的肌肉組織總蛋白，用PGC-1

4、α的多克隆抗體做Western blot，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉組織中檢測到有更多PGC-1α的表達(dá)。
　　 通過肉眼對肌肉的生態(tài)學(xué)觀察，轉(zhuǎn)基因小鼠的大部分肌纖維呈現(xiàn)出氧化型肌纖維發(fā)紅的特性，而同窩的非轉(zhuǎn)基因小鼠的肌纖維在外觀上是蒼白的。用小鼠肌肉組織制作石蠟組織切片，對轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠的肌纖維進(jìn)行HE染色，通過觀察肌纖維的形態(tài)，可以看出：轉(zhuǎn)基因小鼠含有部分的Ⅰ型肌纖維，而在非轉(zhuǎn)基因小鼠中幾乎都是Ⅱ型肌纖維。這些結(jié)果表明