橘小實蠅RNAi及其對RNAi的免疫耐受機制研究.pdf

1、RNAi是由dsRNA引發(fā)的，靶向切割mRNA的高效特異的基因沉默技術。由于該技術具有高效性和便捷性，因此RNAi技術在包括基因功能研究、高通量靶標基因篩選、基因治療、藥物靶標預測和農(nóng)業(yè)病蟲害防治等領域均有廣泛應用。RNAi實現(xiàn)方式包括顯微注射、浸泡和飼喂法。雖然RNAi是一種廣泛存在于多種真核生物并高度保守的機制，但是RNAi的應用仍然面對很多問題，例如包括許多雙翅目昆蟲在內(nèi)的部分物種中RNAi難以實現(xiàn)和RNAi效應持續(xù)時間較短等。橘

2、小實蠅的RNAi研究目前尚屬空白。橘小實蠅是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，為害250多種蔬果。本研究以橘小實蠅為研究對象，建立橘小實蠅的飼喂法RNAi體系;利用RNAi技術研究橘小實蠅spr基因和共生病毒功能;首次發(fā)現(xiàn)了橘小實蠅對RNAi的免疫耐受現(xiàn)象并闡述其機制。
　　1.成功建立了橘小實蠅飼喂法RNAi體系。直接喂食靶標基因dsRNA和喂食表達靶標基因dsRNA的大腸桿菌均可以實現(xiàn)目的基因沉默。其中rpl19 dsRNA喂食組橘小實蠅r

3、pl19基因表達量在喂食后第1天和第7天分別出現(xiàn)了89％和85％的下調。在表達rpl19 dsRNA大腸桿菌喂食組中，rpl19基因表達水平于第1天和第7天出現(xiàn)了30％的下調。在V-A TP-D dsRNA喂食組中，V-A TP-D基因表達水平在第4天出現(xiàn)了幅度為36％下調。在表達V-A TP-D dsRNA的大腸桿菌喂食組中，V-A TP-D基因表達水平在第4天出現(xiàn)了50％的下調。我們同時發(fā)現(xiàn)靶標基因在飼喂dsRNA和表達dsRNA的

4、菌液后于第2天或第4天出現(xiàn)了上調。rpl19 dsRNA喂食組橘小實蠅rpl19基因表達量在喂食后第4天出現(xiàn)了3倍的上調。在表達V-A TP-D dsRNA的大腸桿菌喂食組中，V-A TP-D基因表達水平在第2天出現(xiàn)了1.6倍的上調。組織特異性檢測結果表明飼喂法RNAi所引起的RNAi不局限于中腸，可以在頭、生殖系統(tǒng)和脂肪體中觀察到。其中，noa dsRNA喂食RNAi導致noa基因表達水平于生測后第2天在頭、卵巢、精巢和脂肪體中分別出

5、現(xiàn)了64％、23％、95％和89％的下調。連續(xù)喂食rpl19 dsRNA12天后，rpl19基因表達水平恢復到正常，與egfp dsRNA喂食組無顯著差異。同時，使用500ng/μl、100ng/μl和10ng/μl rpl19 dsRNA進行橘小實蠅喂食RNAi實驗均觀察到rpl19基因表達水平于12天后恢復至正常水平。使用羽化后5天和羽化后10天橘小實蠅進行的rpl19 dsRNA喂食實驗也觀察到這一現(xiàn)象。上述結果表明這一現(xiàn)象與生測

6、所用橘小實蠅的蟲齡以及生測使用的dsRNA濃度無關。對F2代成蟲RNAi效應檢測結果表明親代的RNAi干擾對子代沒有影響。對子代初羽化成蟲進行的rpl19 dsRNA喂食實驗結果表明rpl19基因表達水平下調了66％，與親代未經(jīng)RNAi處理的F2代成蟲喂食RNAi結果一致。
　　2.我們首次發(fā)現(xiàn)橘小實蠅可以對RNAi產(chǎn)生免疫耐受并闡述了其機制。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi導致rpl19基因下調66％;在此基礎上進行的

7、第二次喂食rpl19 dsRNA的RNAi無法引起rpl19基因下調。結果表明第一次針對內(nèi)源基因的RNAi可以使橘小實蠅對RNAi產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象。同時這種免疫耐受現(xiàn)象是非基因特異的。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi同樣使橘小實蠅對第二次喂食spr dsRNA的RNAi產(chǎn)生免疫，spr表達水平在第二次RNAi中不出現(xiàn)下調。1000ng/μl rpl19dsRNA引起的橘小實蠅對RNAi的免疫耐受性持續(xù)20-30天;100ng/

8、μl和10ng/μlrpl19 dsRNA引起的橘小實蠅對RNAi的免疫耐受性分別持續(xù)10-20天和5天，表明橘小實蠅對RNAi的免疫耐受性的持續(xù)時間和第一次RNAi中所使用的dsRNA濃度相關。通過巴弗洛霉素處理橘小實蠅腸道，我們發(fā)現(xiàn)橘小實蠅的dsRNA攝取是由胞吞機制調控的。熒光免疫染色研究結果表明在對RNAi免疫耐受的橘小實蠅中，dsRNA攝取機制受到了阻遏，dsRNA無法正常進入細胞。在對RNAi免疫耐受的橘小實蠅中，chc、l

9、ight、cog3、ap50和ninac等基因均出現(xiàn)了30％-60％的下調，表明其對RNAi的免疫耐受性是由胞吞機制的活性下降所引起的。這一結論也得到了高通量測序結果的支持。高通量測序發(fā)現(xiàn)參與細胞運輸?shù)腸hc、actin1、actin2和actin5等基因出現(xiàn)下調。而通過利用雙氧水促進肌動蛋白形成可以解除橘小實蠅對RNAi的免疫耐受。5％的H2O2與100ng/μl rpl19 dsRNA共喂食引起對RNAi免疫耐受的橘小實蠅中rpl1

10、9基因表達水平出現(xiàn)50％的下調。這些研究結果證實了胞吞機制受阻是橘小實蠅對RNAi產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象的關鍵原因。
　　3.通過上述建立的RNAi技術發(fā)現(xiàn)spr參與了橘小實蠅交配后抗氧化脅迫能力的改變。通過克隆獲取橘小實蠅spr基因全長，該基因編碼324個氨基酸。cDNA序列十分保守，與地中海實蠅spr相似度為86％（E值=0）。spr表達模式結果顯示spr在中腸中表達量最高，其次為后腸和頭部。spr在不同發(fā)育階段的橘小實蠅中均有表達

11、，其中在幼蟲和蛹期表達水平最高。研究結果發(fā)現(xiàn)橘小實蠅交配后雌蟲的抗氧化脅迫能力下降。在雙氧水生測中，交配后的雌蟲存活率明顯低于未交配雌蟲，生測開始后72小時的交配組雌蟲存活率為9.4％，在同一時間點，未交配雌蟲存活率為56.7％(p=0.017)。同時交配后TOR信號通路的rheb基因上調了88％、tor基因上調了28％。此外，TOR通路的關鍵效應基因s6k上調了54％，表明橘小實蠅對氧化脅迫敏感性上升;而通過顯微注射spr dsRNA

12、，成功敲除spr，使spr基因表達水平下調了75％后，橘小實蠅交配后抗氧化脅迫能力不變，TOR通路基因的表達水平也未發(fā)生變化。這些結果表明spr通過TOR通路參與了橘小實蠅交配后抗氧化脅迫能力的改變。
　　4.利用RNAi技術研究橘小實蠅共生病毒的功能。根據(jù)DGE和轉錄組測序結果，我們鑒定了8個橘小實蠅共生病毒序列。其中contig1697、contig475、comp2791和comp11365編碼雙順反子病毒科病毒的結構蛋白或

13、者非結構蛋白。comp3227和comp16524編碼RdRp聚合酶，屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)。我們利用comp11365病毒RdRp序列確認其分類地位為小RNA病毒目(Picornavirales)、雙順反子病毒科（Dicistroviridae）、蟋蟀麻痹病毒屬(Cripavirus)，并將其命名為Bdv-1。Bdv-1病毒主要分布于橘小實蠅中腸，其含量為生殖系統(tǒng)的3000倍。使用飼喂法干擾Bdv-1表達后，我們