家蠶Serpin家族蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、蛋白酶抑制劑的主要功能是抑制蛋白酶活性，廣泛分布于動物、植物、真菌、細(xì)菌和病毒等生物體內(nèi)。在蛋白酶抑制劑中分布最多，研究最為廣泛的就是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitors，SPIs），該類蛋白酶抑制劑主要調(diào)節(jié)蛋白酶的水解級聯(lián)過程，調(diào)控動物、昆蟲體內(nèi)凝血、炎癥反應(yīng)、彈性蛋白修復(fù)、組織分化和凋亡等過程;在植物中，絲氨酸蛋白酶抑制劑還可以防御昆蟲和病原菌的侵害，調(diào)控逆境中蛋白酶的過度水解破壞，以及在增加抗蟲

2、性等都起到了重要作用。絲氨酸蛋白酶按照作用機理可以分為三類:典型、非典型和serpin。典型絲氨酸蛋白酶采取傳統(tǒng)的鎖鑰模型結(jié)合底物，而serpin類抑制劑則是通過活性中心環(huán)狀區(qū)（reactive centre loop）與底物以牢固的共價結(jié)合方式形成復(fù)合體，產(chǎn)生不可逆的抑制效果。
　　本文的研究中將模式生物家蠶作為主要研究對象。研究表明，絲氨酸蛋白酶抑制劑通過精確的調(diào)控蛋白酶水解，參與家蠶的生長、發(fā)育、蛻皮和變態(tài)等生長發(fā)育過程，并

3、且與抵御病原微生物入侵響應(yīng)過程密切相關(guān)。但是已有研究的serpin類蛋白酶抑制劑集中在脂肪體、絲腺、消化系統(tǒng)、體液和繭殼中，對于體壁中的研究較少，不僅如此，現(xiàn)有的研究報道集中在蛋白酶抑制劑的分離和鑒定階段，對于很多重要的serpin類蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系尚不明了。在家蠶的免疫防御過程中，病原微生物主要通過分泌胰蛋白酶等酶類水解穿透體壁。所以本文對家蠶體壁中的胰蛋白酶抑制劑做了詳細(xì)的研究，并且對SW-AT-1的結(jié)構(gòu)與功能間的

4、關(guān)系做了詳細(xì)闡述。
　　本文建立了以硫酸銨沉淀和Trypsin inhibitor Sepharose4B親和層析為主要步驟的純化方法，從P50品系的體壁總蛋白中部分純化了胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitors，TIs)。通過明膠活性電泳技術(shù)，在分離膠上觀察到具有胰蛋白酶抑制性的條帶在12條以上，與體液中的活性分離結(jié)果相比，體壁中的胰蛋白酶抑制劑分布較少，其主要不同活性位置在膠上分離出4個條帶，分別在70 kDa、3

5、5-45 kDa和25 kDa附近;在熱穩(wěn)定性研究中，家蠶體壁中的胰蛋白酶抑制劑活性條帶在60℃以上開始減少和變淡，說明其熱穩(wěn)定性不高;僅有兩個分子量在18-25 kDa間的活性條帶表現(xiàn)出了極強的熱穩(wěn)定性，甚至在100℃處理后，仍然可以保持一定活性。酸堿穩(wěn)定性實驗中觀察到體壁中的所有胰蛋白酶抑制劑活性條帶變化差異微小，說明這些TIs可以在酸性(pH3)或弱堿(pH10)環(huán)境中保持穩(wěn)定的活性，具有一定的酸堿穩(wěn)定性。
　　將部分純化后

6、的SDS-PAGE和活性電泳結(jié)果對照，選擇純化后分離蛋白濃度較高，在活性膠檢測中表現(xiàn)出強抑制活性的3條膠條，并且這三個膠條對應(yīng)蛋白酶抑制劑都是體壁中特有的。切下酶解后進行MALDI-TOF-MASS質(zhì)譜鑒定，收集到大量的肽段質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)(PMF)，通過在Mascot的UniProt數(shù)據(jù)庫中檢索找到對應(yīng)PMF信息的蛋白。鑒定出三個抑制劑相關(guān)蛋白，分別是silkworm antitrypsin isoform1(SW-AT-1)、類絲氨酸

7、蛋白酶抑制劑和一個肽酶，UniProt登陸號分別為:C7ASM9、Q1HPQ5和D2KMR2，理論分子量分別為43428.4 Da、43345.43 Da和77611.43 Da，等電點分別為5.41、5.19和6.37。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)silkworm antitrypsinisoform1屬于serpin家族;Q1HPQ5則是一種具有特定水解活性位點，在部分水解后才能激活的胰蛋白酶抑制劑前體。下一步的研究旨在對鑒定的蛋白酶抑

8、制劑的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系探究，所以我們選擇將SW-AT-1和Q1HPQ5進行基因克隆，并通過構(gòu)建原核重組載體，進行體外重組表達(dá)。對表達(dá)后的重組蛋白進行結(jié)構(gòu)與功能研究。
　　將已獲得的蛋白質(zhì)氨基酸序列通過NCBI的Protein BLAST，找到和SW-AT-1和Q1HPQ5相對應(yīng)的編碼mRNA全序列，GenBank登陸號分別為:FJ613793和NM_001046997.2。已有報道表明SWAT基因有10個外顯子和9個內(nèi)含子，其中9個

9、外顯子分別構(gòu)成4個選擇性拼接選擇性拼接異構(gòu)體，分別為SW-AT-1、SW-AT-2、SW-AT-3和SW-AT-4，已有文獻報道SW-AT-1在體內(nèi)表達(dá)量最高，并主要存在于體壁中，這四個選擇性拼接異構(gòu)體基因的堿基差異對位于mRNA序列的1200-1210 bp的位置，也是成熟肽編碼區(qū)域的末端。通過氨基酸序列對比，確定從體壁中分離純化得到的鑒定蛋白就是SW-AT-1，所以選擇SW-AT-1的CDS區(qū)域作為基因克隆的模版。在目的片段的PCR

10、擴增和測序結(jié)果中只檢測到SW-AT-1基因，而未檢測到其他的三個選擇性拼接異構(gòu)體基因。該基因CDS區(qū)含有1310個核苷酸，共編碼392個氨基酸，實驗中設(shè)計的特異引物切除了信號肽編碼區(qū)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析也表明SW-AT-1含有典型的serpin家族抑制劑的結(jié)構(gòu)域。實驗中通過菌液PCR、雙酶切驗證和DNA序列測序驗證原核重組pET-28a-SW-AT-1的構(gòu)建成功。將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌C43表達(dá)菌株進行原核表達(dá)，結(jié)果顯示SW-AT-1存在破

11、碎菌體的上清液中，而Q1HPQ5則形成無活性的包涵體沉淀，無法進行下一步實驗。
　　將大腸桿菌C43中表達(dá)的重組蛋白利用Ni-NTA親和層析法純化，并洗脫出大量的純化蛋白。在測定純化的SW-AT-1重組蛋白抑制活性中，首次發(fā)現(xiàn)SW-AT-1還具有胰蛋白酶抑制功能。其胰蛋白酶活性熱變性溫度在47-50℃之間，熱穩(wěn)定性不高，與之前的明膠活性電泳結(jié)果相符;其酸堿穩(wěn)定性則相對較高，在pH3-pH10之間活性很穩(wěn)定，在強酸或堿性環(huán)境中無活性

12、。對胰凝乳蛋白酶的抑制活性測定后，SW-AT-1均表現(xiàn)出同樣的穩(wěn)定性。接著通過抑制劑常數(shù)的確定，分析表明SW-AT-1對兩種蛋白酶的親和力極高，Ki值分別為為1.73×10-10 M和0.86×10-10 M，與胰凝乳蛋白酶的結(jié)合力力更強，在酶的動力學(xué)作用關(guān)系上表現(xiàn)為競爭性抑制。
　　通過3D建模對SW-AT-1的三級結(jié)構(gòu)進行模擬，結(jié)構(gòu)模擬采取基于SWISS-MODEL服務(wù)器的同源預(yù)測方法，蛋白模板為煙草天蛾serpin1K復(fù)合體

13、(PDB序號:1SEK)，Procheck和Verify3D的模型評估結(jié)果均證明模擬結(jié)構(gòu)正確、可靠。接著在NCBI的保守結(jié)構(gòu)與分析中，再次確定RCL區(qū)域的結(jié)構(gòu)模擬可靠性，三維模擬結(jié)構(gòu)表明確定的氨基酸位點G327，A328，E329和A330位于RCL的N-端，F(xiàn)352，N353，A354，N355，K356和P357位于RCL的C-段，對應(yīng)上述10個位點進行定點氨基酸殘基替換的突變實驗，構(gòu)建出10個突變體G327A、A328G、E329

14、G、A330G、F352A、N353D、A354G、N355S、K356G和P357G。采取同樣的步驟進行原核表達(dá)和純化，獲得的純化蛋白和野生型進行圓二性色譜分析，結(jié)果顯示野生型二級結(jié)構(gòu)中:α螺旋占33％，β折疊占16％;野生型SW-AT在不同溫度和pH中的活性變化與三級結(jié)構(gòu)的圓二色性圖譜變化呈現(xiàn)一致性，而二級結(jié)構(gòu)的變化則無對應(yīng)性，所以SW-AT-1的三級結(jié)構(gòu)決定了其抑制功能。在3D模擬結(jié)構(gòu)中，RCL是SW-AT-1結(jié)構(gòu)域中的一個凸出暴

15、露區(qū)域，該區(qū)域是控制SW-AT-1功能的關(guān)鍵區(qū)域;并且在突變體的活性檢測和圓二色性圖譜中，突變體G327A和E329G均表現(xiàn)出抑制活性的劇烈降低以及二級、三級結(jié)構(gòu)的明顯變化，證明G327和E329氨基酸殘基是RCL正確折疊與否的關(guān)鍵位點;除此之外，突變體K356G則表現(xiàn)出活性的明顯升高和三級結(jié)構(gòu)變化，以及三級結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性提高，證明在RCL區(qū)域的近C-端區(qū)域，將末端位點替換為較小的氨基酸殘基，可以增加RCL與蛋白酶底物的結(jié)合能力，并增加