鎘誘導(dǎo)人肝腎細(xì)胞自噬及相關(guān)蛋白作用初步研究.pdf

1、已有研究表明鎘（＞20μM）可誘導(dǎo)人肝腎細(xì)胞凋亡，但是，鎘能否誘導(dǎo)人肝腎細(xì)胞自噬目前還不是很清楚。本研究旨在分析鎘誘導(dǎo)HEK293和WRL68細(xì)胞的自噬，及自噬與凋亡的關(guān)系。本研究分為三部分:1.構(gòu)建pcDNA3.1-GFP-LC3B重組質(zhì)粒，為建立快速檢測細(xì)胞自噬的方法打下基礎(chǔ);2.探究鎘（0～10μM）能否引起HEK293和WRL68胞自噬;3.探究HEK293細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系。
　　本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、基因重組及基因轉(zhuǎn)染

2、、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)、顯微及超微結(jié)構(gòu)觀察等細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了pcDNA3.1-GFP-LC3B真核表達(dá)載體。檢測了鎘（0～10μM）誘導(dǎo)人肝腎細(xì)胞的自噬標(biāo)志基因LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá);初步探究了自噬過程中ERK1/2和AKT的作用。用流式細(xì)胞術(shù)檢測了鎘(0～10μM)誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞的凋亡。探究了自噬抑制劑3-MA對自噬與凋亡的影響，并分析了自噬與凋亡的關(guān)系;觀察了極低濃度鎘（0～2.0μM）長時(shí)間40 d

3、處理HEK293后細(xì)胞形態(tài)變化情況，以分析自噬與和轉(zhuǎn)化的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.通過PCR擴(kuò)增出LC3B基因，與pcDNA3.1-GFP載體相連，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-GFP-LC3B真核表達(dá)載體，且能在HEK293和WRL68細(xì)胞中成功表達(dá)。
　　2.低濃度鎘（0～10μM）處理HEK293和WRL68細(xì)胞，均可引起細(xì)胞自噬，表現(xiàn)為LC3B-Ⅱ表達(dá)量增加、熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光點(diǎn)狀聚集、透射電鏡下觀察