骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在急性肝損傷大鼠肝臟內(nèi)定植能力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、我國(guó)是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，每年有眾多的患者發(fā)展到終末期肝病、肝衰竭，目前最為理想的治療選擇為肝移植術(shù)，然而此手術(shù)存在供體的緊缺、手術(shù)侵襲性大、術(shù)后免疫排斥以及高額的治療費(fèi)用等臨床和社會(huì)問(wèn)題，其廣泛應(yīng)用受到限制。肝細(xì)胞移植也是治療肝功能衰竭和代謝性肝臟疾病的有效方法，細(xì)胞移植治療方法日益受到人們的關(guān)注，然而也面臨肝細(xì)胞來(lái)源不足的臨床應(yīng)用難題，限制了其在臨床的應(yīng)用。 20世紀(jì)90年代以來(lái)興起的干細(xì)胞技術(shù)日漸成熟，成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究

2、熱點(diǎn)。干細(xì)胞具有極強(qiáng)的自我更新能力和一定的分化潛能，是組織工程和細(xì)胞治療理想的種子細(xì)胞。人體內(nèi)多種組織和器官內(nèi)存在的間充質(zhì)干細(xì)胞是目前公認(rèn)的多潛能干細(xì)胞，它由中胚層發(fā)育而來(lái)，具有很強(qiáng)的可塑性。近年的研究證明人骨髓來(lái)源的BMSc具有向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化潛能，由于其取材方便、供源豐富、分離培養(yǎng)簡(jiǎn)單、增殖迅速，并且無(wú)免疫排斥反應(yīng)，易于轉(zhuǎn)染外源基因，因而有望成為肝病細(xì)胞治療和基因治療的理想細(xì)胞。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖洽俳⒎€(wěn)定的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)

3、胞(bonemesenchymal stem cells，BMSCs)體外分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)體系；②建立大鼠急性肝衰竭動(dòng)物模型；③用BrdU標(biāo)記、示蹤觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在急性肝損傷大鼠肝臟內(nèi)定植情況。 實(shí)驗(yàn)方法： 1．BMSCs的分離培養(yǎng)，傳代和表型鑒定：取7-8周齡近交系雄性Lewis大鼠骨髓細(xì)胞，梯度密度離心法分離獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞；用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12低糖培養(yǎng)基，采用反復(fù)貼壁

4、法，獲得貼壁生長(zhǎng)的BMSCs，并擴(kuò)增BMSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD90、CD29、CD45、CD54、CD11b抗原的表達(dá)。 2．5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記BMSCs 3．急性肝衰竭動(dòng)物模型的制備： 用D-氨基半乳糖(1.5g/Kg)腹腔注射制備大鼠急性肝衰竭模型。 4．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)： (1)細(xì)胞移植：試驗(yàn)分三組(A、B、C組)，經(jīng)陰囊上靜脈向肝衰竭組(A組)及肝臟正常(c組)的大鼠移植

5、標(biāo)記Brdu的BMscs 1～1.5×10<'6>，同時(shí)向肝衰竭組(B組)的大鼠注射等量的生理鹽水作為移植對(duì)照。2周后觀察大鼠的存活率及肝功能恢復(fù)情況，并通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠肝臟中BrdU<'+>細(xì)胞數(shù)量及分布。 (2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：移植2周A組、B組動(dòng)物存活率、肝功能恢復(fù)情況無(wú)明顯差異，肝損傷組(A組)及肝臟正常組(C組)大鼠肝臟均可檢測(cè)到BrdU<'+>細(xì)胞分布，但A組與C組相比，A組BrdU<'+>細(xì)胞數(shù)較多，分布更廣