紅曲霉產(chǎn)色素相關(guān)基因的克隆及功能研究.pdf

1、紅曲霉(Monascus spp.)是我國傳統(tǒng)的食用和藥用微生物,在我國已有上千年的應(yīng)用歷史。它能分泌產(chǎn)生色素、莫吶可啉類(monacolins)物質(zhì)、γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid,GABA)、麥角固醇和豐富的水解酶類等多種有益代謝產(chǎn)物,是生產(chǎn)食品發(fā)酵劑、著色劑、保健食品、藥品或其原料的重要微生物資源。目前,國內(nèi)外對紅曲霉菌種的分類、選育、代謝產(chǎn)物分離純化及發(fā)酵條件的研究較多,而有關(guān)紅曲霉的分子生物學研究才剛剛起

2、步。GenBank檢索結(jié)果查見,與紅曲霉相關(guān)的核酸序列大部分是研究分類和親緣關(guān)系的,有關(guān)功能基因的研究很少,而關(guān)于紅曲霉產(chǎn)色素基因的研究尚未見報道。
　　 近年來,利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)T-DNA轉(zhuǎn)化真菌獲得突變體的方法成為尋找和鑒定新基因的有效手段。本課題采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化法建立了包含5100多株轉(zhuǎn)化子的紅曲霉轉(zhuǎn)化子庫,從轉(zhuǎn)化子庫中篩選得到了24株菌落顏色發(fā)生了

3、明顯變化的色素突變子,并對其菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)、潮霉素抗性穩(wěn)定性及主要代謝產(chǎn)物的分泌能力等進行了分析。在此基礎(chǔ)上,采用TAIL-PCR分離到8株色素突變子T-DNA插入位點的左側(cè)序列,并應(yīng)用RACE技術(shù)克隆得到了一株色素突變子805＃T-DNA插入位點的cDNA全長序列,采用基因敲除(gene knock-out)技術(shù)對其功能進行了驗證。具體研究結(jié)果如下:
　　 1、轉(zhuǎn)化子庫的構(gòu)建及色素突變株的篩選
　　 通過優(yōu)化農(nóng)桿菌

4、(A.tumefaciens)介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化紅曲霉的條件,構(gòu)建了包含5100多個轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化子庫。T-DNA的PCR驗證結(jié)果表明,隨機挑選的60株轉(zhuǎn)化子均含有T-DNA插入片段。24株隨機挑選的轉(zhuǎn)化子的Southern雜交結(jié)果表明,T-DNA單拷貝插入率為70.8％。通過對轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)的觀察,篩選得到53株形態(tài)發(fā)生明顯變化的轉(zhuǎn)化子,其中24株為菌落顏色發(fā)生顯著變化的色素突變子,其編號分別為189＃、192＃、533＃、635＃、

5、733＃、805＃、959＃、1132＃、1164＃、1263＃、1295＃、2066＃、2606＃、2887＃、3108＃、3257＃、3715＃、3742＃、4081＃、4096＃、4591＃、4698＃、4963＃和4968＃。色素突變子連續(xù)傳代培養(yǎng)5代后,除733＃、1132＃、3715＃和4591＃外,其它20株色素突變子均能在潮霉素抗性培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長,潮霉素抗性穩(wěn)定性達83.3％。
　　 2、色素突變子產(chǎn)紅曲色素、

6、monacolin K、GABA和桔霉素的分析
　　 采用UV-VIS、TLC、HPLC等方法對上述20株潮霉素抗性穩(wěn)定的色素突變子的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物紅曲的色素(包括色價、吸收波長、色素組分)、monacolin K、GABA和桔霉素的產(chǎn)生情況進行了分析。結(jié)果表明,與出發(fā)菌株相比,色素突變子產(chǎn)代謝產(chǎn)物的能力都發(fā)生了不同程度的變化。
　　 在產(chǎn)色素方面,色素突變子959＃的色價最高,達2712,是出發(fā)菌株M-7色價1228的2

7、.2倍；1263＃的色價最低,僅為20,只有出發(fā)菌株M-7色價的0.01倍。另外,色素突變子紅曲乙醇萃取液的UV-VIS掃描圖譜和色素組分也發(fā)生了顯著的變化。在產(chǎn)monacolin K方面,突變子4081＃紅曲的含量最高,達1601μg/g,而出發(fā)菌株M-7紅曲的含量低于0.1μg/g。在產(chǎn)GABA方面,突變子1263＃紅曲含量最高,達6183.9μg/g,是出發(fā)菌株M-7436.3μg/g的14.2倍；635＃紅曲的含量最低,只有15

8、6.1μg/g,約為出發(fā)菌株M-7的0.33倍。在產(chǎn)桔霉素方面,突變子635＃紅曲的含量最高,達154.57＃g/g,是出發(fā)菌株0.75μg/g的206倍；1295＃含量最低,為0.10μg/g,為出發(fā)菌株的0.1倍。
　　 比較上述20株色素突變子產(chǎn)色素和桔霉素的情況,可將其分為4類:第一類,色價和桔霉素都升高的,包括635＃、959＃、1164＃、2066＃、2606＃、2887＃、4081＃和4698＃共8株；第二類,色價

9、和桔霉素都降低的,包括805＃、1295＃、3742＃和4968＃共4株；第三類,色價降低而桔霉素含量升高的,包括189＃、192＃、1263＃和4963＃共4株；第四類,色價升高而桔霉素降低的,包括533＃、3108＃、3257＃和4096＃共4株。從上述四類突變子中挑選出635＃、1164＃、2606＃、805＃、1295＃、189＃、1263＃、4963＃、533＃和3257＃共10株代表性菌株,作為研究紅曲霉產(chǎn)色素相關(guān)基因的材料

10、。
　　 3、色素突變子T-DNA插入位點側(cè)翼序列TAIL-PCR擴增及擴增片段功能分析
　　 采用TAIL-PCR法對上述10株色素突變子T-DNA插入位點的側(cè)翼序列進行了擴增,得到了635＃、1164＃、2606＃、805＃、3257＃、189＃、4963＃和533＃共8株突變子T-DNA插入位點左側(cè)的DNA序列,擴增的DNA片段長度介于500bp～1300bp之間。FASTA比對分析表明,805＃突變子DNA擴增序

11、列與煙曲霉(Aspergillusfumigatus)Af293的G蛋白信號調(diào)節(jié)子(regulator for G-protein signaling,RGS)功能域的同源性達84％；其它7株突變子的T-DNA插入位點側(cè)翼的DNA序列未發(fā)現(xiàn)有功能明確的相似性序列。突變子533＃、1164＃和2606＃的DNA擴增片段已經(jīng)登陸Genbank,登陸號分別為DQ861336、DQ861338和DQ1337。
　　 4、紅曲霉G蛋白信號

12、調(diào)節(jié)子的功能驗證
　　 以突變子805＃擴增序列的Blast比對分析結(jié)果為依據(jù),設(shè)計特異性引物,采用RACE技術(shù),擴增得到了對應(yīng)于該DNA序列的2012bp的cDNA序列。ORFfin工具分析顯示,其包含的最長開放讀碼框架(open reading frame,ORE)為1851bp,推衍得到包括了RGS和2個DEP(disheveled,Egl-10,pleckstrin)3個結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的氨基酸序列。以RGS結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的DNA