棉花EREBP基因和WD-repeat基因的克隆及功能分析.pdf

1、EREBP轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育、環(huán)境脅迫及防御反應(yīng)等方面具有重要作用，本研究通過酵母單雜交技術(shù)首次從棉花中分離了兩個編碼類EREBP的cDNA片段，命名為GhEREB2和GhEREB3。GhEREB2和GhEREB3編碼的蛋白都含有一個高度保守的AP2/EREBPdomain、一個核定位信號和一個激活域，且與一些EREBP轉(zhuǎn)錄因子的相似性比較高，推測其屬于EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的B3亞族。GhEREB2和GhEREB3具有較高的相似性，尤

2、其是AP2/EREBPdomain的相似性更高，為97.4％。GhEREB2和GhEREB3基因的編碼閱讀框內(nèi)都有一個內(nèi)含子，且位于AP2/EREBPdomain區(qū)域外。RT-PCR分析表明，GhEREB2在棉花的根、莖和葉都表達(dá)，而GhEREB3僅在葉表達(dá)。GhEREB2和GhEREB3的表達(dá)被乙烯和JA誘導(dǎo)，且乙烯誘導(dǎo)的強(qiáng)度大于JA，但JA處理時，GhEREB2和GhEREB3mRNA積累的速度較快。干旱和低溫能誘導(dǎo)GhEREB2的

3、表達(dá)，但不能誘導(dǎo)GhEREB3的表達(dá)。另外，GhEREB2、GhEREB3能在原核生物中高效表達(dá)，且特異地識別、結(jié)合GCC-box，并激活報告基因His3和LacZ的表達(dá)，表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)錄激活能力。將GhEREB2、GhEREB3基因分別構(gòu)建到pCAMBIA1304表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，得到經(jīng)PCR證實(shí)的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子。以上研究表明，GhEREB2或許作為一個正調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子參與生物和非生物脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

4、途徑，而GhEREB3或許僅作用于生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。 WD-repeat蛋白在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運(yùn)輸和RNA加工等過程中具有重要作用，而植物中WD-repeat蛋白的研究比較少。本研究通過菌落原位雜交法從棉花中克隆到一個長1156bp的cDNA片段，命名為GhWDR，其編碼蛋白的N-末端有四個WD基元，且與擬南芥、水稻、哺乳動物及酵母等真核生物的WD-repeat蛋白有明顯的相似性，推測其屬于WD-repeat蛋白家族的一個新成員

5、。RT-PCR分析表明，GhWDR基因在棉花的根、莖和葉都表達(dá)，但表達(dá)量不同。此外，GhWDR基因在原核生物中也能高效的表達(dá)。將GhWDR基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入野生型擬南芥。PCR和GUS檢測證實(shí)，GhWDR基因已經(jīng)整合到擬南芥的基因組，且能穩(wěn)定表達(dá)。轉(zhuǎn)基因擬南芥的T1代種子對潮霉素的抗性發(fā)生了分離，部分株系的分離比接近3∶1，而其它株系的分離比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于或低于3∶1。T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的營養(yǎng)器

6、官和生殖器官都表現(xiàn)出GUS活性，但表達(dá)強(qiáng)弱不同，在生理活性旺盛的部位，如根尖分生區(qū)、苗期的子葉和真葉以及根、莖、葉和花絲的維管系統(tǒng)，表現(xiàn)出明顯的GUS活性，而根毛、根冠、萼片、花瓣、花藥、雌蕊及種子(種柄除外)等部位的GUS活性不明顯。TMpredServer和PSORT6.4軟件預(yù)測，GhWDR位于細(xì)胞質(zhì)，可能與膜系統(tǒng)結(jié)合，且轉(zhuǎn)基因擬南芥葉表皮細(xì)胞的GUS染色表明，GhWDR主要位于細(xì)胞壁附近和葉綠體，分析其可能通過結(jié)合細(xì)胞膜或葉綠體