我國養(yǎng)殖太平洋牡蠣中諾瓦克樣病毒的檢測及部分核酸序列的分析.pdf

1、諾瓦克樣病毒(Norwalk-likeviruses，NLVs)是一組形態(tài)和生物學特征類似的無包膜的正的單鏈RNA病毒的統(tǒng)稱。其形態(tài)微小，圓形，直徑為26-35nm，屬于杯狀病毒科。根據(jù)病毒RNA聚合酶區(qū)或衣殼蛋白核苷酸和氨基酸序列的同源性比較，將NLVs分為3個基因組：基因Ⅰ組(代表株NV)、基因Ⅱ組(代表株SMA)、Sapporovirus。美國聯(lián)邦疾病控制中心(CentersforDiseaseControlandPreventi

2、on，CDC)對1976-1980年腹瀉流行的調(diào)查報告表明約有42％的胃腸炎暴發(fā)與NLVs有血清學聯(lián)系。NLVs能耐受不良的外界環(huán)境、感染持續(xù)時間長，且僅10-100個病毒粒子就能引起感染，所以說它的危害性不可低估。我國1995年從患兒的糞便標本中發(fā)現(xiàn)了第一例NLVs。靖宇等人曾經(jīng)應用免疫酶聯(lián)技術(shù)從北京市醫(yī)院門診非細菌性腹瀉病人的血清標本中檢測到NLVs，廣州也有生食NLVs污染的蟹肉引發(fā)的急性胃腸炎的報道，這都說明在我國NLVs是存在

3、的。美國和日本已報道了大量由于生吃貝類食物而暴發(fā)的NLVs感染引起的流行性胃腸炎。我國是水產(chǎn)品大國，每年都養(yǎng)殖大量的貝殼類水產(chǎn)品，尤其牡蠣是我國第一大養(yǎng)殖貝類，產(chǎn)量居貝類首位。每年我國都會向日本等國出口大量的牡蠣，此外在我國江浙沿海地區(qū)，人民喜歡生食貝類等海產(chǎn)品。因而建立一種快速的檢測方法，一方面可以避免疾病的發(fā)生，保護人們的健康，另一方面，也可以監(jiān)控出口海產(chǎn)品的質(zhì)量。 到目前為止國內(nèi)還沒有關于檢測養(yǎng)殖牡蠣中諾瓦克樣病毒存在情況

4、的相關報道。本論文利用pH9.5的甘氨酸緩沖液性處理牡蠣勻漿液，PEG沉淀病毒粒子的方法對未知的是否污染有諾瓦克樣病毒的牡蠣樣品進行處理，并提取病毒RNA，進行RT-PCR法對37份牡蠣樣品進行了檢測，共檢測到6個陽性樣品。從2002年11月到2003年4月份這一期間內(nèi)所采集的牡蠣樣品中，分離出的NLVs最多，說明冬天為牡蠣污染NLVs的高峰期。對于其中的糞便陽性樣品和牡蠣分離樣品的PCR產(chǎn)物進行純化、連接及轉(zhuǎn)化，獲取重組克隆并測序。重

5、組質(zhì)粒序列測定結(jié)果在NCBI上進行BLASTn序列比對發(fā)現(xiàn)這些病毒分離株均屬于GⅡ型。且與GeneBank上的日本株的同源性較高(＞94％)。這說明了地理關系上較近的NLVs之間的同源性較高。這就為設計公共引物提供了基礎。六個病毒株的RNA聚合酶區(qū)部分237個堿基序列之間的相似度為79.2％.其中糞便樣品與日本牡蠣樣品的相似度為77.0％，而與其他4個牡蠣樣品的相似度較低，分別為56.7％、56.1％、57.3％和65.3％。日本牡蠣樣

6、品與本試驗中的牡蠣樣品之間的相似度略高于糞便樣品，分別為72.4％、73.6％、73.0％和79.4％。而本試驗中分離得到的四個病毒株之間的相似度為95.5％。尤其是1、3、5號樣之間的相似度高達99.0％以上。由此我們推斷從中國牡蠣樣品中分離出的幾個病毒株之間同源性高，可以認為是一種基因型的病毒。而與日本的病毒株之間存在較顯著的差異，和糞便分離株之間存在明顯差異。糞便分離株、日本牡蠣分離株和中國牡蠣分離株之間RNA聚合酶部分序列的差異

7、性也說明了NLVs在遺傳上的多樣性。其中日本牡蠣分離株與Lordsdalevirus(X86557)在遺傳上比較接近；中國的4個牡蠣分離株與Mexicovirus(U22498)在遺傳上比較接近。 為了進一步驗證RT-PCR的試驗結(jié)果，我們又進行了寡核苷酸探針雜交試驗。根據(jù)已發(fā)表的NLVs的RNA聚合酶區(qū)的序列設計了一條生物素標記的寡核苷酸探針。用該探針對我們的病毒分離株的RT-PCR產(chǎn)物和插入有這些產(chǎn)物片段的質(zhì)粒菌進行雜交試驗

8、，結(jié)果與RT-PCR一致。通過寡核苷酸探針雜交試驗，我們可以不用再做克隆、測序和序列比對工作，就可以驗證RT-PCR的結(jié)果，排除假陽性的結(jié)果。這對于只做一般樣品檢測的工場和實驗室，尤其是對于大批量樣品檢測來說，在確保結(jié)果的正確性的基礎上節(jié)省了開支和時間。 因為NLVs至今仍無法通過細胞培養(yǎng)法在實驗室進行培養(yǎng)，所以無法通過一般常用的方法進行定量分析。我們建立了一個基于RT-PCR的檢測諾瓦克樣病毒的定量分析試驗方法。通過該試驗我們