戊型肝炎病毒中和表位研究.pdf

1、戊型肝炎是發(fā)展中國家的一種主要的急性腸道傳染病。其在孕婦感染者的病死率卻可高達20﹪，尤其是后3個月的妊娠晚期者最高可達56﹪。1986～1988年間我國新疆南部的HEV大流行造成了12萬人發(fā)病，千余人死亡。目前，越來越多的證據(jù)表明戊型肝炎是一種人畜共患病。其危害日益被人們所重視。但由于至今尚未建立有效的HEV細胞培養(yǎng)模型或簡便的病毒繁殖模型，國內(nèi)外學者對戊型肝炎病毒的發(fā)病、致病機理和疫苗的研究都相對緩慢。 HEV是一種無包膜二

2、十面體對稱結構RNA病毒，其主要免疫表位集中在病毒衣殼，由ORF2編碼的單一蛋白。在大腸桿菌中表達的ORF2的一個片段(NE2)可以自發(fā)形成以二聚體為基礎的多種聚合結構，二聚體蛋白與病人血清的反應性顯著強于單體蛋白，提示二聚體蛋白形成了HEV的重要免疫優(yōu)勢表位。NE2蛋白免疫恒河猴可以對HEV產(chǎn)生完全的保護性。本研究用分析超離技術測得NE2蛋白在溶液中主要形式的沉降系數(shù)為2.65S，分子量為46kDa，摩擦比為1.69，提示為中度不對稱

3、性的二聚體形式。 基于上述研究結果，本研究用NE2抗原制備了多株單克隆抗體，其中6株對二聚體的反應性強于單體，提示識別構象型表位；2株對二聚體、單體及變性蛋白的反應性相當，提示識別線性表位。進一步，我們通過體在體外用MAb進行HEV的免疫捕獲PCR，證實MAb8C11、13D8和8H3能夠直接捕獲病毒，提示它們識別病毒顆粒表面的暴露結構。通過ELISA及生物傳感器驗證這三株MAb的交叉阻斷實驗發(fā)現(xiàn)，8C11和13D8可以相互完全

4、阻斷，提示識別同一表位區(qū)域，而13D8對8H3不能阻斷，8C11非但不能阻斷8H3，而且對8H3的結合有顯著增強作用。 利用Biacore生物傳感器測定這3株MAb及其Fab的親和常數(shù)(KD)，8C11和13D8的KD值均為20nmol/L左右，其Fab片段的KD值較完整抗體有數(shù)十倍的提高，可解釋為完整抗體的二價效應；MAb8H3的KD值為1000nmol/L左右，但其Fab的KD值降低了105，提示Fab可以更容易地接近抗原表

5、位并與之結合，意味著E2抗原上的8H3表位被其他結構所部分遮蓋，而8C11與抗原的結合可能引起了抗原空間結構的改變，從而去除了對8H3表位的遮蓋，導致8H3與抗原結合的顯著增強。沉降速度實驗測得8C11和8H3的沉降系數(shù)分別為6.21S和6.37S；NE2過量的溶液中，中和MAb8C11和NE2結合牢固，復合物的沉降系數(shù)為7.59S，未見游離的8C11分子，而8H3親和力較低呈可逆結合，復合物的沉降系數(shù)為9.64S，c(s)分布中有顯著

6、的8H3游離組分。病毒捕獲PCR證實了8C11對8H3結合的增強作用同樣存在與天然HEV，而不僅僅是在重組抗原NE2上的假象。用8C11、8H3分別以及聯(lián)合孵育HEV，再感染恒河猴，結果8C11和8H3均可中和HEV的感染性和致病性，而且二者有明顯的協(xié)同中和作用，證實8C11和8H3均識別病毒中和表位。進一步研究上述兩個中和表位，我們用MAb和恒河猴感染系列血清及戊型肝炎患者血清進行了阻斷實驗，結果表明中和表位8C11和8H3的抗體產(chǎn)生